不同宿主来源犬瘟热病毒的分离及致病相关基因序列分析

李天松，王 磊，王胜乐，姜 雪，许微微，李元果，高玉伟，3，王铁成，3，黄 耕，3，夏咸柱，3

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所，吉林 长春 130122；3.吉林省人畜共患病预防与控制重点实验室，吉林 长春 130122）

犬瘟热（CD）是由犬瘟热病毒（CDV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病［1］，是目前国内外犬、貂、狐狸等经济动物的主要传染病之一，常造成巨大经济损失。CDV致病性相关的蛋白主要是V蛋白、F蛋白。V蛋白能干扰干扰素（Interferon，IFN）通路，促进病毒对宿主的逃逸［2］。F蛋白诱导膜融合，其先以无活性的前体F0形式存在，被宿主蛋白水解酶裂解［3－5］成信号肽、F1、F2亚单位［6］。F1亚单位包括几个在促进膜融合中有重要作用的区域：跨膜区（TM）、胞质尾区（CT，20～40残基）、融合肽（FP）-在所有的CDV毒株中高度保守。此外，F1还包括两个七价重复区：HRA、HRB［7］。本试验从我国CDV发病死亡犬、狐狸体内分离到4株病毒，基因进行克隆及测序后对其V基因、F基因进行分析，报告如下。

1 材料与方法

1.1 病料样品 样品来自于自然发病死亡藏獒（TM）、四川犬、潍坊狐狸、松源狐狸，临床表现为发热，血便，食欲减退，鼻内有水样液体流出，眼角有分泌物，皮肤有少量皮疹。剖检留肺脏、脾脏、肠等器官，－70℃保存备用。

1.2 载体、感受态细胞及相关试剂 载体p EASYT Simple Vector及DH5α感受态细胞、pfu高保真DNA聚合酶及d NTP，购自北京全式金生物技术有限公司；质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒，购自AXYGEN公司；AMV反转录酶，购自Sigma公司；RNA提取试剂盒，购自Bio Flux；FITC标记的羊抗鼠二抗，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；抗CDV单克隆抗体由本实验室制备；其他试剂，购自Ta KaRa公司。

1.3 细胞 Vero-DST（Vero-DogSLAMTag）细胞，由本实验室构建及保存。DMEM，购自Gibco公司，细胞培养瓶，购自于Costar公司。

1.4 病料的处理 －70℃取出肺及脾，称重后冰上研磨至匀浆，按重量体积比1∶10加入无血清的含有1 000 IU／m L双抗的DMEM继续研磨约3 min。倾出匀浆液4℃3 000 r／min离心10 min，5 000 r／min离心10 min，无菌吸出上清备用。

1.5 细胞培养 Vero-DST 75 cm2瓶内长成单层，加入病料上清液2 m L，33℃感作1 h后加入20 m L含有2%犊牛血清的DMEM，37℃培养，每天观察细胞病变，如无病变第5天冻融收毒再接Vero-DST细胞。如此传代至第5代用于鉴定及序列测定。

1.6 病毒鉴定

1.6.1 电镜检查 取第5代Vero-DST细胞毒200 μL 1 000 r／min离心10 min后取上清进行电镜检查。1.6.2 间接免疫荧光鉴定及TCID50测定 Vero-DST消化计数，调整为2×105个／m L按100μL／孔铺96孔板。培养12 h弃上清接种10倍连续稀释的猴、犬Vero-DST第5代毒，每个稀释度接4个孔，100μL／孔，37℃培养5 d。以抗CDV单克隆抗体为一抗、FITC标记的羊抗鼠抗体为二抗（含0.3%伊文斯蓝）进行间接免疫荧光鉴定，以阳性孔算为病变孔按Reed-Muench方法TCID50。

1.6.3 PCR鉴定、引物设计及合成 PCR鉴定引物根据CDV N基因保守区设计并由Ta KaRa公司合成，目的片段大小为477 bp，引物序列：CDV-F：5′-GTGACTGCTCCTGATACTGC-3′、CDV-R：5′-ACCAACTCCCATAGCATAAC-3′。病 毒 液 提 取CDV基因组并反转录并鉴定，设阳性及阴性对照。1.6.4 5株CDV分离毒的V基因、F基因序列克隆及测定 根据GenBank上发表的强毒株A75／17（AF164967.1）序列设计引物，全基因共分为17段进行PCR，电泳回收阳性片段并连接p EASY-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞后涂于Amp＋LB平板，挑取10个菌落于5 m L 2倍Amp＋的LB液体培养基37℃摇均，12 h用AXYGEN公司质粒小提试剂盒提取质粒，阳性质粒送TaKaRa公司测序，每个片段送5个样。测序结果拼接后将V、F蛋白 氨 基 酸 序 列 与 5804（AY386315.1）、A75／17（AF164967.1）、Onderstpoort（AF014953.1）、CDV3（EU726268.1）、Snyder Hill（GU138403.1）等共20多株强毒株、疫苗株进行比较，分析5株CDV与参考毒株之间的V、F蛋白氨基酸衍化特征。

2 结果

2.1 病毒分离及鉴定结果 所有病毒接种Vero－DST培养至第5代并无明显细胞病变产生（见图1 B），细胞形态与对照细胞（见图1 A），略有差异。5d后收毒，细胞冻融物电镜检测可见有典型的副黏病毒样颗粒，形态呈圆形和多形性（见图2），由此可初步确定分离到犬源和狐狸源CDV，并命名为CDVTM-CC、CDV-Dog-SCh、CDV-Fox-SY、CDV-Fox-WF。

以CDV-TM-CC与 CDV-Fox-WF为代表进行间接免疫荧光鉴定，Vero-DST细胞对照在荧光显微镜下全部细胞均为红色（见图3A）。而低稀释倍数接毒细胞可见有散在发绿色的细胞，个别细胞内可见有多个核，形成多核巨细胞（见图3B、图3C）。荧光分布显示没有大面积的荧光团，故在光镜下没有形成肉眼可见的细胞病变。计算CDV-TM-CC TCID50为 103.5／m L，CDV-Monkey-BJ TCID50为102.5／m L。

4株分离毒与本实验室保存的猴源CDV-Monkey-BJ提取 RNA，经反转录，特异引物鉴定按CDV-Monkey-BJ、CDV-TM-CC、CDV-Dog-SCh、CDV-Fox-SY、CDV-Fox-WF顺序进行电泳，结果可见5株病毒、阳性对照在500 bp左右有明显的条带，大小一致，而三馏水阴性对照无条带（见图4），因此PCR结果为阳性。

由上述数据可证实，用Vero-DST细胞系分离到4株猴源CDV病毒，病毒在Vero-DST细胞上传5代没有形成细胞病变。

图4 5株细胞毒PCR鉴定结果

2.2 F蛋白序列分析 CDV-TM-CC、CDV-Monkey-BJ、CDV-Dog-SCh、CDV-Fox-WF和CDV-Fox-SY F蛋白分析，可见5株与强毒株氨基酸同源性在93.8%～99.1%，而与弱毒株同源性在90.4%～93%之间，因此5株分离毒与强毒株的亲缘关系较近。分析F蛋白内部可见信号肽与F1、F2相比变异较大，13～37位、72～112位之间氨基酸变化最大，有多处存在连续3个氨基酸不同。疫苗株有27个特有氨基酸，在这27个位点5株与其完全不同。108～110位的NAT潜在N-糖基化位点为强毒株和5株分离株所共有，疫苗株没有（见图5）。

F2区域内208K、216L和 F1区域：390F、431I、616S（位于TM区）、646A（位于CT区）是疫苗株共有4个特有的氨基酸位点。CDV-TM-CC、CDVMonkey-BJ、CDV-Dog-SCh、CDV-Fox-WF and CDV-Fox-SY在这6个位点与强毒株一致。此外，CDV-Monkey-BJ还有7个特有位点：317R、347I、465I、466T、471P、472W、586N，全部集中于F1片段上，这可能是其引起猴发病的分子基础。F1、F2区域共有4个潜在N－糖基化位点：141～143 NLS、173～175 NVS、179～181 NCT、517～519 NQS，前三者位于F2亚基内，NQS位于F1亚基内。HQS位于F1亚基内。

在二硫键形成和蛋白的空间构型中半胱氨酸（C）起着主要的作用。本试验所分离到的5株CDV F蛋白与强毒株、疫苗株均有17个半胱氨酸残基，且为强毒株与疫苗株共有。因此空间构型上强毒株与弱毒株可能一致。

2.3 V蛋白分析 V蛋白与CDV的毒力有关，强毒株的V基因可干扰宿主干扰素（IFN）通路，从而有利于CDV的宿主逃逸。5株Vero-DST V基因与参考毒株氨基酸序列分析表明，其与强毒株同源性在92%～99.7%之间，与疫苗株的同源性在89.3%～93.3%之间，V蛋白疫苗株与强毒株共有9个位点是完全不一致的CDV-Monkey-BJ在这9个位点上完全与强强株一致，说明本株毒与强毒株亲缘关系较近。

对比麻疹病毒（Measles virus）与CDV的V蛋白，272位存在C／R的差异，用swiss-model网站进行C272R突变同源蛋白空间构象模拟，结果显示，结合Zn分子的能力下降（见图6）。这对下一步CDV V基因的研究提供理论依据。

图6 V蛋白C272R突变空间构象模拟

3 结论与讨论

利用本实验室构建的Vero-DST细胞系分离到4株CDV 并命名为 CDV-TM-CC、CDV-Dog-SCh、CDV-Fox-WF 和 CDV-Fox-SY。 在 Vero-DST 细胞上传到5代病毒并不形成细胞病变，10代以后产生细胞病变，通过后续的研究中发现，CDV-TM-CC株10代与5代在F基因内存在三个氨基酸位点差异，这三个位点可能与细胞病变形成有关。

V蛋白、F蛋白是与CDV致病性相关的两个主要蛋白，F蛋白在病毒的入侵及细胞之间的传播是至关重要，5株病毒分析结果显示，CDV-Monkey-BJ F1区域内有7个特有位点：317R、347I、465I、466T、471P、472W、586N，这些位点可能与其能引起灵长类动物发病有关。值得关注的是586N位于HRB内，而HRB在膜融合过程中参与6螺旋体的形成［8］。F2、F1亚基内潜在 N-末端糖基化位点5株病毒与参考序列一致，这比Sultan等［9］2009报道的部分AisaⅡ型毒株少一个糖基化位点，因此其抗原性可能与其有差异。

V蛋白可干扰IFN通路中部分因子的磷酸化及其向核内转移，因此在CDV抗宿主干扰素作用中起关键性作用。V蛋白序列分析表明，5株CDV与强毒株亲缘关系较近，同源性为94%～99.7%。国外学者报道V蛋白110Y、272C两个位点在抗宿主IFN作用中起到关键作用［10－11］。本试验对CDVMonkey 5代毒V蛋白序列进行空间构象同源模拟也证实C272R突变使其失去Zn结合能力下降，从而改变锌指结构的空间稳定性。

综上所述，本试验分离到4株CDV，并将其命名 为 CDV-TM-CC、CDV-Dog-SCh、CDV-Fox-SY、CDV-Fox-WF株，其在V蛋白、F蛋白与强毒株亲缘关系较近。后续通过雪貂试验证实其确为强毒株，但其对犬、猴的致病性如何还需进一步试验。

［1］殷震，刘景华.动物病毒学［M］.2版.北京：科学出版社，1997：756-762.

［2］Fontana J M，Bankamp B，Rota P A.Inhibition of interferon induction and signaling by paramyxoviruses［J］.Immunological reviews，2008，225（1）：46-67.

［3］Iwatsuki K，Miyashita N，Yoshida E，etal.The nucleotide and predicted amino acid sequence of the fusion protein of recent isolates of canine distemper virus in Japan［J］.The Journal of veterinary medical science／the Japanese Society of Veterinary Science，1998，60（3）：381-385.

［4］Kovamees J，Blixenkrone-Moller M，Sharma B，etal.The nucleotide sequence and deduced amino acid composition of the haemagglutinin and fusion proteins of the morbillivirus phocid distemper virus［J］.J Gen Virol，1991，72 （Pt 12）：2959-2966.

［5］Visser I K，van der Heijden R W，van de Bildt MW，etal.Fusion protein gene nucleotide sequence similarities，shared antigenic sites and phylogenetic analysis suggest that phocid distemper virus type 2 and canine distemper virus belong to the same virus entity［J］.J Gen Virol，1993，74（Pt 9）：1989-1994.

［6］von Messling V，Cattaneo R.Amino-terminal precursor sequence modulates canine distemper virus fusion protein function［J］.J Virol，2002.76（9）：4172-4180.

［7］Plattet P，Cherpillod P，Wiener D，etal.Signal peptide and helical bundle domains of virulent canine distemper virus fusion protein restrict fusogenicity［J］.J Virol，2007，81（20）：11413-11425.

［8］von Messling V，Milosevic D，Devaux P，etal.Canine distemper virus and measles virus fusion glycoprotein trimers：partial membrane-proximal ectodomain cleavage enhances function［J］.J Virol，2004，78（15）：7894-7903.

［9］Sultan S，Charoenvisal N，Lan N T，etal.The Asia 2 specific signal peptide region and other domains in fusion protein genes characterized Asia 1 and Asia 2 canine distemper viruses［J］.Virol J，2009，6：157.

［10］Rothlisberger A，Wiener D，Schweizer M，etal.Two domains of the V protein of virulent canine distemper virus selectively inhibit STAT1 and STAT2 nuclear import［J］.J Virol，2010，84（13）：6328-6343.

［11］Takaki H，Watanabe Y，Shingai M，etal.Strain-to-strain difference of V protein of measles virus affects MDA5-mediated IFN-beta-inducing potential［J］.Mol Immunol，2011，48（4）：497-504.