丹参滴注液制备工艺中的碱处理工艺优化研究

范步高 徐国生（上海长征富民金山制药有限公司，上海 201506）

丹参滴注液制备工艺中的碱处理工艺优化研究

范步高 徐国生（上海长征富民金山制药有限公司，上海 201506）

目的：在保证丹参滴注液质量标准对原有丹参素钠和原儿茶醛等指标含量要求的前提下，提高丹酚酸B新增指标的含量。方法：采用正交试验方法，优化碱处理工艺的相关参数。结果：最佳碱处理条件为A2B2，即pH 7.0～7.5，煮沸30 m in。结论：最佳 A2B2条件能够减少丹酚酸B的过度降解，使丹酚酸B在丹参滴注液中含量相对较高。

丹参滴注液；丹酚酸B；碱处理；热稳定性；正交试验

丹酚酸B是唇形科植物丹参（SalviamiltiorrhizaBge.）的干燥根和根茎中含量最高、且具强烈清除自由基和抗氧化作用的最强活性成分，对心、脑、肝、肾等多个器官均具有保护作用[1-4]。在中国药典2005年版（一部）中第1次将丹酚酸B列入了丹参药材的含量测定项目[5]，但未将其列入现行的丹参类单、复方注射液含量测定项目中（见表1）[6-10]，但按照国家食品药品监督管理局（SFDA）有关中药注射剂质量标准提高工作的要求，国家药典委员会在原有标准制法的框架下已逐步将丹酚酸B等含量测定项目列入相关品种的提高标准草案中（见表1）[11-12]。为保证中药制剂质量的稳定均一、安全有效，建立多指标含量测定的必要性[13]已形成共识，并将作为中药制剂质量标准研究的一项指导原则。本研究介绍的对丹参滴注液制备工艺中碱处理工艺的优化研究，即为在丹参滴注液质量标准提高工作中所要求的在现行国家标准制法框架下，在不过多影响丹参素钠和原儿茶醛等原有指标含量的前提下，最大限度提高新增指标丹酚酸B在丹参滴注液中的含量（为方便不同产品或不同中间品间的相互比较，本研究的有效成分含量单位统一折算为mg/g生药）。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪（安捷伦1100），TP6001-N电子天平（上海精密科学仪器有限公司），W 501升降恒温水浴锅（上海申生科技有限公司），R501旋转蒸发器（上海申生科技有限公司），PZ-D-5型液体比重天平（上海良平仪器仪表有限公司），丹参滴注液生产用设备等。

1.2 材料

丹参药材（河南洛阳），丹参75%醇沉液（上海长征富民金山制药有限公司），乙醇（药用），丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B对照品（上海中药标准化研究中心）。

表1 丹参类注射液有效成分含量要求比较

2 方法与结果

2.1 丹参素钠、原儿茶醛等含量测定

依据丹参滴注液质量标准[8]进行测定。

2.2 丹酚酸B含量测定[11]

依据高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥD）测定。

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（KROMASIL 100-5C18，250mm×4.6mm）；以乙腈为流动相A，0.03%磷酸水溶液为流动相B，按表2进行梯度洗脱；流速为0.8 m L/min，柱温30℃；检测波长288 nm。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于10 000。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取丹参素钠、原儿茶醛和丹酚酸B对照品适量，加10%甲醇制成每1 m L含丹参素钠0.5 mg、原儿茶醛0.05 mg和丹酚酸B 0.1 mg的混合溶液（也可制备单一的丹酚酸B对照品溶液，本法与“2.1”所检测的丹参素钠和原儿茶醛含量结果无显著差异，可互为准确性检验，本研究中丹参素钠和原儿茶醛的含量结果采纳“2.1”法），过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取相应中间产品样品用纯化水稀释至16 g生药/250 m L或成品适量，再用纯化水稀释10倍，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2.4 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，按峰面积用外标法计算其含量。

2.3 碱处理正交试验

丹参滴注液标准处方：64 g丹参净药材经水提、纯化处理后与50 g葡萄糖混合，用注射用水配制成1 000 m L丹参滴注液，其标准制备方法[8]与一般丹参类注射液相比，最大不同之处是在丹参第1次75%醇沉液浓缩后的“pH 9煮沸水解1小时”操作，这一碱处理步骤，可以使丹酚酸B被加速分解，而目标成分丹参素（钠）和原儿茶醛的含量将会随之增加[13]。所以，“碱处理”条件（pH值、煮沸时间）的优化是提高丹酚酸B在丹参滴注液中含量的关键。

表2 丹参检测梯度洗脱

2.3.1 样品制备 样品制备方法按SFDA颁布的丹参滴注液质量标准进行[8]。取同批次丹参第1次75%醇沉液，减压浓缩后，按表3的因素水平表，并根据表4的试验设计表进行pH调节和煮沸时间控制。每个试验为500 g生药量，水解后取样、检测（碱处理前原料液丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B含量分别为5.34、1.35、9.25 mg/g，总评分为 2.26）。

表3 因素水平

表4多重指标综合评分标准：各含量分值按含量最高值得1分，最低值得0分，中间值得分=（中间值－最低值）/（最高值－最低值）。每个试验总评分按因素重要性分配权重（根据丹参素和原儿茶醛为丹酚酸B分解物或其他考量自定）计算，即总评分（yi）=丹参素钠分值 +原儿茶醛分值+丹酚酸B分值×2。

表 4 L9（34）试验计划及试验结果

2.3 .2 极差分析

表5 极差分析

根据表5极差分析结果，对丹参素钠和原儿茶醛，最佳工艺为A3B3。对丹酚酸B，则最佳工艺为A1B1。而对“三者兼顾”的总评分而言，交互因子A×B则为主要因子，其因子趋势图（图1）也显示A与B有很强交互作用的“交叉”提示。

对有显著交互作用因子A×B，可由图1或因子A、B水平搭配表（表6）确定A2B2组合为最佳工艺条件，即调节pH至7.5，煮沸40 m in进行处理。

图1 A×B交互因子趋势（总评分）

表6 因子A、B水平搭配（总评分）

2.3.3 方差分析 进行方差分析（F检验）的假设条件是每一试验独立进行、每一试验条件下的指标服从正态分布。为提高方差分析结果的置信度，经Shapiro-Wilk法正态性检验（简称W检验。当统计量W＞W（n，α）临界值时，样本总体在α显著性水平下接受正态性假设），丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、总评分等试验结果的总体分布在α=0.01显著性水平下均具正态性（表7）。方差分析（A×B因子列作为F值计算的分母）结果表明（表8）：A因子对丹参素钠、原儿茶醛和丹酚酸B指标均为关键因子，B因子对丹酚酸B指标则为重要因子，而A、B因子对总评分的F值均小于1，同样提示存在较强的A×B交互作用，分析结果及优选方案与极差分析相同。

表7 试验结果总体分布正态性检验

表8 试验结果方差分析

2 .4 验证试验

根据实验目的，选择“三者兼顾“的总评分分析结果的最佳碱处理工艺条件A2B2进行工业化放大试验验证，并根据生产设备等实际条件，确定碱处理条件为pH值7.0～7.5，煮沸30 m in后停止加热，并按标准工艺[8]进行后续的生产操作，得丹参滴注液灭菌样品，进行各项检测。

3批合并投料600 kg丹参净药材，经三次水煎煮、浓缩、75%醇沉、冷藏，取上清液浓缩后分成每批200 kg生药量，3批后续操作中间产品及成品的含量检测数据取其均值（表 9）。

表9 工业化放大验证试验含量变化

丹参滴注液碱处理工艺按上述正交试验优化条件进行验证，并将所得样品进行各项检测均合格，表明pH 7.0～7.5煮沸30 m in的最佳碱处理工艺条件可行。若仅从优化角度以丹酚酸B为考察指标，则应以取消碱处理为最佳，但丹参素钠和原儿茶醛的含量将会有较多降低，表10为完全碱处理（按标准工艺[8]pH=9时煮沸1 h）与取消碱处理的含量变化比较（每2批小试投料640 g丹参净药材，至75%醇沉浓缩后均分2批，1批进行完全碱处理完成后续操作，另1批直接进行85%醇沉完成相同的后续操作，该批号用“*”标注），结果2批完全碱处理的丹参滴注液成品的丹酚酸B含量均为0，但丹参素钠（均值12.43 mg/g生药）和原儿茶醛（均值1.77 mg/g生药）的含量提高较多；取消碱处理的2批丹参滴注液成品的丹酚酸B含量均值高达7.49 mg/g生药，而丹参素钠（均值8.06 mg/g生药）和原儿茶醛（均值1.20 mg/g生药）的含量则相对降低较多，但均能符合丹参滴注液的含量测定要求[8]。

3 分析与讨论

3.1 丹酚酸B的降解因素及措施

丹酚酸B是丹参中活性较强、含量最高的酚酸类有效成分。在低温、弱酸性条件下其性质相对稳定，但对热不稳定，在水煎煮和浓缩等高温操作过程中即已逐渐降解生成丹参素和原儿茶醛（表4、9）以及咖啡酸、紫草酸、迷迭香酸等其他酚酸类有效成分[15-16]，特别是在碱性、高温条件下则加速降解[17]，这也可由表5、8、10得到验证。所以，生产中为减少丹酚酸B的“过度”降解，除应严格控制pH值等关键工艺参数外，还需注意提高“热处理”工作效率，防止容器局部过热和料液受热时间过长。

3.2 丹酚酸B“醇沉”损失的因素及措施

在2005年版和2010年版中国药典[5,18]中，均规定丹参原药材（干燥品）含丹酚酸B不得少于3.0%（若按规定不得过13.0%水分折算，丹酚酸B应不少于26.1 mg/g生药），但在丹参类注射液中丹酚酸B的含量均很少，而丹参素钠和原儿茶醛也不是很高，尤其是注射液（小针剂）。比较表 9的操作过程，丹酚酸B和丹参素钠在第1次75%醇沉操作中即被沉淀的杂质“包裹”而损失很大一部分。所以，在醇沉操作中除应按标准严格控制浓缩液的相对密度、醇沉的最终醇浓度外，加醇浓度、加醇速度及搅拌效果等相关参数的优化，也是减少丹酚酸B等有效成分醇沉损失的一个重要关注点（表10小试操作质量有较大提高），若有发现醇沉渣（沉淀）形成过早、有效成分损失过大，合理地采用相同醇浓度的乙醇对醇沉渣进行一次有效成分的再提取，也是减少丹酚酸B等有效成分醇沉损失的一个有效补救措施[19]。

表10 丹参滴注液小试完全碱处理与取消碱处理的含量变化比较

致谢！本文检测工作由倪慧芳技师等质检科同仁完成。

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Study on the Process Optimization of Alkali Treatment in the Preparation of Danshen Drip Liquid

Fan Bugao，Xu Guosheng（Shanghai Treeful Pharmaceutical Co.，Ltd.，Shanghai201506，China）

Objective：To increase the content of the new ly added indicator of salianolic acid B on the premise of ensuring the contents of sodium danshensu and protocatechuic aldehyde according to the quality standards of Danshen drip liquid.Methods:To optimize the parameters of the process of alkali treatment through orthogonal experiment.Results:The optimized alkali treatment condition was A2B2（pH 7.0 ～ 7.5，boiling for 30 m ins）.Conclusion:The optimized condition of A2B2can reduce the over-degradation of salianolic acid B，thus the relatively high content of salianolic acid B in Danshen drip liquid can be obtained.

Danshen Drip Liquid；Salvianolic Acid B；Alkali Treatment；Thermal Stability；Orthogonal Test

范步高，男，工程师，执业药师。研究方向：药品生产工艺、技术研发。E-mail：fanbugao@treeful.com.cn

2011-04-01）