多奈哌齐对AD大鼠海马结构神经元的保护作用

高旭红 赵海花 赖 红 唐忠艳 姜 薇 李秀明

（中国医科大学基础医学院人体解剖学教研室，沈阳110001）

β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）是阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）脑内老年斑的主要成分，大量研究表明Aβ的异常沉积是AD的重要病因［1］，其毒性作用是AD进行性发展的关键因素，有研究表明神经元的凋亡可能是导致神经元丢失的主要原因［2］。PI3-K／Akt通路是细胞内重要的促细胞存活途径，Akt是PI3-K的直接下游作用靶点。活化的Akt可以磷酸化凋亡相关基因，通过改变它们的活化状态而使促凋亡基因失活、抗凋亡基因活化，从而起到抑制细胞凋亡及促进细胞存活的作用。在AD的发病过程中，Aβ致神经元损伤作用是否与抑制了Akt的活化有关等方面的国内外研究尚少。因此，本实验拟通过侧脑室注射Aβ制作AD动物模型，同时给予多奈哌齐进行治疗，采用免疫组化和Western blot等方法，探讨Aβ对神经元的损伤及多奈哌齐（Donepezil，DN）对海马结构神经元的保护作用，为AD药物的研制提供新的思路，为预防或治疗AD奠定理论基础。

材料和方法

1.实 验动物及分组

选用中国医科大学实验动物中心提供的36只雄性3月龄 Wistar大鼠，体重250-300g。实验分为3组：即对照组、模型组和治疗组，每组12只。模型组及治疗组大鼠经10%水合氯醛0.35ml／100g腹腔麻醉后，固定于鼠脑立体定位仪上，参照图谱《The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates》及 文献［3］于前囟后0.8mm，中线右侧旁开1.5mm，垂直进微量加样针3.6mm，将10μg（1μg／μl）聚集态的Aβ25－35溶液在5min内缓慢注入侧脑室内。造模后3d，治疗组大鼠腹腔注射多奈哌齐1.5mg／kg／d，对照组、模型组大鼠腹腔注射等量的生理盐水，持续4w。

2.主 要试剂与仪器

Aβ25－35（Sigma公司），caspase-3 抗体 （武 汉博士德公司），T-Akt、P-Akt抗体（北京博奥森公司），多奈哌齐（卫材药业有限公司），鼠脑立体定位仪（SN-2，日本），石蜡切片机（leitz，德国），磁力加热搅拌器（78-1型），凝胶成像仪、电泳仪（上海天能科技有限公司），Morris水迷宫（DM S-2，中国），高速台式冷冻离心机（TGl-16）。

3.M orris水迷宫行为学测试

测试3组大鼠对平台位置的学习记忆能力。治疗组大鼠多奈哌齐治疗1d后3组大鼠进行Morris水迷宫［4］行为学测试。实验历时4d，每天上、下午各训练2次，记录大鼠寻找并爬上平台的时间为逃避潜伏期（Escape latency），即从大鼠入水到找到平台的时间。

4.免 疫组化标本制备及染色方法

水迷宫测试结束后，将各组大鼠用10%水合氯醛3.5ml／kg腹腔注射麻醉后，经左心室灌注生理盐水150ml，再灌注4%多聚甲醛（0.1mol／L PB，pH 7.4）250ml，持续30min后取脑，脑块厚度0.3-0.5cm，在相同缓冲液中后固定3-24h，梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，石蜡切片机冠状位连续5μm切片。

采用SABC法行免疫组化染色，切片常规脱蜡至水，30%H2O220ml加蒸馏水200ml混合，室温10min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗5min×3次；用微波炉进行热修复抗原后；用5%BSA封闭液室温封闭30min；滴加caspase-3一抗（1∶200）4℃过夜；次日，室温滴加生物素化山羊抗兔IgG作用30min，再滴加SABC作用30min；室温下DAB显色15-20min，镜下控制反应时间；苏木素复染，自来水返蓝15min；常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

5.W estern blot方法

水迷宫测试结束后，每组4只大鼠颈椎脱臼处死、断头、剥离并取出双侧海马结构，将100g海马结构剪碎加入0.5ml裂解液，冰上放置30min匀浆，4℃12000g／min低温离心30min，取上清。考马斯亮蓝法进行蛋白定量，行SDS-PAGE电泳，5%浓缩胶（88v，30min），10%分离胶（110v，30min），然后湿转到PVDF膜上（60v，2h），5%脱脂奶粉（用TTBS配制）室温封闭2h，分别加小鼠抗大鼠T-Akt（1∶200），兔抗大鼠 P-Akt（1∶200）和抗β-actin抗体（1∶200）4℃冰箱过夜，TTBS洗膜10min×3次，分别与辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG（1∶5000）室温下孵育1h，TTBS洗膜10min×3次，将PVDF膜置于保鲜膜上，A、B发光液按1∶1比例混合，滴加A、B混合液，进行发光，经凝胶自动分析成像系统进行成像。

7.统 计学分析

以上所得数据以均数±标准差（¯x±s）表示，应用SPSS11.5软件单因素方差分析进行组间比较。P＜0.05为有统计学意义，P＜0.01为有显著统计学意义。

结 果

1.M orris水迷宫测试

水迷宫测试结果表明：3组大鼠平均逃避潜伏期在前2d均随着训练逐渐缩短，但无明显差异。自第3d起，模型组与对照组相比大鼠平均逃避潜伏期明显延长，有显著性差异（P＜0.01），而治疗组较模型组相比则明显缩短（P＜0.01，图1）。

2.大 鼠海马结构神经元caspase-3的表达

镜下可见caspase-3阳性产物呈棕黄色或棕褐色细颗粒状，主要积聚在海马CA1、CA3区的锥体细胞层及齿状回（Dentate gyrus，DG）的颗粒细胞层，表达在神经元胞浆和轴突。经苏木素复染后可见神经元胞核较大，呈淡蓝色，核仁清晰。CA1区为小锥体细胞，排列成2-3层，CA3区为大锥体细胞，细胞数是 CA1区的1.5-2.0倍。对照组海马CA1、CA3及 DG caspase-3表达的神经元数量较少，阳性产物染色较浅（照片1a、2a、3a）；而模型组CA1区可见阳性反应产物分布于神经元胞浆及突起，CA3区神经元排列松散，DG颗粒细胞较小，排列紧密，海马结构3个亚区caspase-3的表达较对照组明显增多P＜0.01，（表1；照片1b、2b、3b）；而治疗组海马结构3个亚区的表达较模型组减少P＜0.05，（表1；照片1c、2c、3c）。

图1 3组大鼠平均逃避潜伏期的变化趋势Fig.1The mean escape latency variation of three groups rats※※Compared with the control group ，P＜0.01；▲▲Compared with the model group，P＜0.01

3.T -Akt、P-Akt的表达

如3组大鼠海马结构T-Akt和P-Akt的Western blot结果所示（图2），在相对分子量为56kDa处有一清晰的 T-Akt和P-Akt条带，以β-actin为内参采用半定量法测灰度比值进行分析，结果显示三组之间T-Akt的表达没有差异，但模型组与对照组相比P-Akt的表达下调（P＜0.05），而治疗组与模型组相比P-Akt的表达上调（P＜0.05，表2）。

图2 3组大鼠海马结构 T-Akt、P-akt的 Western blot结果Fig.2The western bloting results of T-Akt and P-akt in rat hippocampal formation of 3groups

表1 3组大鼠海马结构神经元caspase-3表达情况比较（平均光密度值，¯x±s）Table 1 The caspase-3expression in rat neurons of hippocampal formation in 3groups（Mean optical density，¯x±s）

表2 三组大鼠海马结构T-Akt、P-Akt的IOD与β-actin IOD的比值比较（¯x±s）Table 2 The relative level ofT-Akt and P-Akt in rat hippocampal formation of 3groups（T-Akt or P-Akt IOD／β-actin IOD，¯x±s）

讨 论

1.A β所致AD大鼠海马结构神经元的损伤

Aβ淀粉样斑块聚集是AD系列病理改变的触发点［5］，本实验采用孵育一周后凝聚态的 Aβ25－35注入大鼠侧脑室，诱导模拟AD行为学和病理学改变的动物模型。本研究水迷宫结果显示随训练天数的增加，各组平均潜伏期逐渐缩短，但AD模型组大鼠每天平均逃避潜伏期均明显长于对照组，与Li等［6］的实验结果相近似。该模型较好地模拟了AD行为学中学习障碍和近期记忆损伤的特征，提示Aβ沉积是导致AD学习记忆障碍的重要原因之一。

Aβ的神经毒性包括两个方面，一是通过诱发凋亡相关基因的表达；二是直接的细胞毒性［7］。海马结构是与认知功能密切相关的重要脑区，大量的研究表明海马结构是AD最早和最易受损的部位［8］。本研究重点观察了和海马结构学习记忆密切相关的CA1、CA3区及DG三个脑区，结果观察到模型组海马CA1、CA3区及DG神经元caspase-3表达较对照组明显增加。说明了海马结构三个亚区的神经元发生了明显的凋亡，导致Aβ所致AD大鼠海马结构学习记忆功能的严重障碍。

PI3-K／Akt信号通路是细胞内重要的促细胞存活途径，PI3-K被细胞外信号活化后，使其下游蛋白激酶Akt发生磷酸化，磷酸化的Akt可通过各种途径调节凋亡相关基因的活化状态，改变它们的活性从而起到抑制神经元凋亡及促进神经元存活的作用，我们在神经元发生凋亡的同时，发现了了模型组的P-Akt的表达量较对照组也呈下调趋势。

2.多 奈哌齐对Aβ所致大鼠海马结构损伤的保护作用

多奈哌齐（Donepezil，DN）作为一种选择性的胆碱酯酶抑制剂，没有肝脏毒性。大量的临床实验证实它能够明显改善AD患者的学习记忆功能。目前体内外研究发现DN可减少自由基的产生、抑制谷氨酸的兴奋性毒性，但其是否可减少Aβ诱导的神经元凋亡，抑制凋亡相关基因caspase-3的表达，以及此作用是否与Akt的活化有关等国内外研究还很少。

Akasofu等［9］研究发现DN对缺血性损害、NMDA的兴奋性毒性和Aβ对原代培养的大鼠脑皮层神经元有保护作用，可以减少乳酸脱氢酶（LDH）的释放。Kimura M 等［10］通过研究推测DN的神经保护的机制可能是直接拮抗Aβ的毒性作用。Svensson AL等［15］也发现DN能保护PC12细胞免受Aβ诱导的毒性作用。本研究水迷宫结果证明：随训练天数的增加，多奈哌齐治疗组与模型组相比平均潜伏期逐渐缩短，DN治疗组大鼠海马结构三个亚区神经元caspase-3表达较模型组明显减少，说明DN有抑制凋亡基因caspase-3表达的作用。治疗组P-Akt的表达量较模型组也呈上升趋势，本结果提示Aβ25－35的神经毒性可能与抑制了Akt的磷酸化水平有关，而DN则有可能通过促进Akt的磷酸化而抑制Aβ的神经损伤作用，进而改善了海马结构的学习记忆功能。

［1］Abramov AY，Duchen MR.Toxicity of amyloid beta Peptide tales of calcim，mitochondria，and oxidative stress.Neurochem Res，2004，29（3）：637-650

［2］Yuan J，Yanker BA.Apoptosis in the neurosis systerm.Nature，2000，407（6085）：802-809

［3］Swapnil Sonkusare，Krishnamoorthy Srinivasan.Effect of donepezil and lercanidipine on memory impairment induced by intracerebroventricular streptozotocim in rats.life Science，2005，77：1-14

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［5］Hardy J，Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease：progress and problems on the road to therapeutics.Science，2002，14（9）：1202-1204

［6］Li Y，Qin HQ，Chen QS，et al.Behavioral and neurochemical effects of the intera hippocampal coinjection of beta-amyloid protein1-40and ibotenic acid in rats.Neurosci，2004，114（12）：1521-1531

［7］Tranzi RE，Moir RD，Wagner SL.Clearance of Alzheimer's Abeta peptide：the many roads to perdition.Neuron，2004，43（5）：605-608

［8］Allen G，Barnard H，McColl R，et al.Reduced hippocampal functional connectivity in Alzheimer disease.Arch Neurol，2007，64（10）：1482-1487

［9］Akasofu S，Kimura M，Ogura H，et a1.Protective efect of donepezil against Aβ（1-40）neurotoxicity in rat septal neurons.Brain Res，2005，1047：72-84

［10］Kimura M，Komatsu H，Ogura H，et al.Comparison of donepezil and memantine for protective effect against amyloid-beta（1-42）toxicity in rat septal neurons.Neurosci，2005，391（12）：17-21