促泌素在胃肠道神经内分泌肿瘤中的表达及其临床意义

王文军 张 帆 何 雷 张菊华

（皖南医学院弋矶山医院病理科，安徽 芜湖241000）

材料和方法

1.材 料

收集2002年1月至2009年1月间皖南医学院弋矶山医院病理科存档石蜡包埋组织，共88例，均为胃肠道手术切除标本。实验组为28例神经内分泌肿瘤（类癌8例、非典型类癌20例），同时选取40例腺癌伴神经内分泌分化及20例腺癌作为对照组，肿瘤分布部位详见表1。所有病例均由两位高年资病理医师根据WHO2000年胃肠道神经内分泌肿瘤分类标准，结合免疫组织化学结果进行病理诊断，术前均未行任何治疗。

2.免 疫组织化学染色

上述存档蜡块组织均为4%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，4μm 厚切片。分别进行促泌素（secretagogin，SCGN）、蛋白基因产物9.5（protein gene product 9.5，PGP9.5）、CD56即神经细胞粘附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）、神经元 特 异 性 烯 醇 化 酶 （neuron specific enolose，NSE）、突触素（synaptophysin，Syn）及嗜铬蛋白 A（chromogranin A，CgA）SP两步法免疫组织化学染色，DAB显色。上述抗体相关信息详见表2，其中SCGN由浙江大学医学院来茂德教授惠赠。所用抗体均采用pH6.0的柠檬酸钠缓冲液高压修复。以PBS代替一抗作空白对照，以已知阳性病例作阳性对照。操作严格按产品说明书进行。

表1 各组消化道肿瘤的分布部位Table 1 The distribution of all gastrointestinal tumors

表2 抗体名称、性质、克隆号、来源、工作浓度及阳性部位Table 2 The characteristics of all markers

3.结 果判断

免疫组织化学染色细胞膜、胞质或胞核出现清晰淡黄色至棕褐色颗粒者为阳性表达细胞。结合染色强度和阳性细胞数进行分级［3］。两人双盲法分别观察切片，选择10个具有代表性的高倍视野（10×40倍），评分后取平均值。染色强度评分标准：不着色为0分，淡黄色为1分，黄褐色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞所占整张切片比例评分标准：阳性细胞数＜5%为0分，5%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，＞75%为4分。两种评分相乘，0分为阴性，≥1分为阳性；阳性率按阳性例数除以总例数计算。若两人观察结果相差3分则重新评定。

4.统 计学分析

应用SPSS13.0统计软件对实验数据进行处理，两两间比较采用χ2Fisher精确检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.S CGN等在胃肠道正常粘膜中的表达

SCGN在胃肠道粘膜固有层腺体弥散的神经内分泌细胞中可呈阳性表达。不过SCGN与CgA和Syn阳性神经内分泌细胞的染色模式有些差别。SCGN阳性细胞大多有长的突起伸入腔缘游离面，即类似于所谓的“开放型”的内分泌细胞，只有少数阳性细胞很少或几乎没有突起伸入腺体腔缘的游离面，即类似于所谓的“封闭型”的内分泌细胞（图1）；而大多数Syn和CgA阳性细胞为圆形、椭圆形或锥形细胞，多为所谓的“封闭型”的内分泌细胞（图2）。PGP9.5、CD56及NSE在胃肠道粘膜弥散性神经内分泌细胞均未见表达。

2.S CGN等在胃肠道腺癌中的表达

除CD56和NSE各在1例腺癌中弱阳性表达外，SCGN、PGP9.5、Syn和CgA在20例胃肠道腺癌中均无表达，各标记物之间均无统计学差异（P＞0.05）（见表3）。

3.S CGN 等在胃肠道腺癌伴神经内分泌分化、非典型类癌及类癌中的表达

SCGN在腺癌伴神经内分泌分化、非典型类癌及类癌中阳性表达率均最高，分别为62.5%（25／40）（图3a、b）、90%（18／20）（图4a、b）和100%（8／8）（图5），PGP9.5阳性表达率均最低分别为32.5%（13／40）、45%（9／20）和37.5%（3／8）（图6），与SCGN比较各组均有显著统计学差异（P＜0.01）；余标记物在各组表达率均较高，与SCGN比较均无统计学差异（P＞0.05）（见表3）。

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4.S CGN等在腺癌、腺癌伴神经内分泌分化、非典型类癌及类癌之间的表达差异

所有标记物在腺癌伴神经内分泌分化、非典型类癌及类癌中的阳性表达率均明显高于腺癌，且均有显著统计学差异（P＜0.01）（表3中未列出）；SCGN、Syn和CgA在类癌、非典型类癌中的阳性表达率均高于腺癌伴神经内分泌分化，且均有统计学差异（P＜0.05）；所有标记物在非典型类癌和类癌之间的阳性表达率均无统计学差异（P＞0.05）（见表3）。

表3 SCGN等标记在胃肠道各组肿瘤中的表达Table 3 Expression of all markers in each group of gastrointestinal tumors

讨 论

SCGN基因定位于6p22.1-22.3，包含六个并行的EF-hand钙结合结构域，属于钙结合蛋白感受器家族。近年的研究显示SCGN在正常神经内分泌细胞和相应肿瘤中均有表达，为一种新型的神经内分泌标记物［4－5］。目前报道的与SCGN具有高亲和力的受体是突触小体相关蛋23和25（synaptosome-associated protein 23kDa and 25kDa，SNAP23 和 SNAP25）。SCGN的作用机制一方面与其较低的Ca2＋亲和力以及在Ca2＋诱导下的构型改变有关，另一方面其与SNAP-23和SNAP-25结合后可以通过Ca2＋信号调节神经内分泌囊泡的转运、引发神经内分泌细胞胞吐作用［6－7］。

神经内分泌细胞主要分布于甲状腺、肾上腺、胰腺、胃肠道、肺等处，其中胃肠道的弥散性神经内分泌细胞数量和种类最多。本实验证实SCGN可显示存在于胃肠道粘膜固有层腺上皮之间的弥散性神经内分泌细胞。不过SCGN阳性细胞大多为“开放型”的内分泌细胞，少数为“封闭型”。而大多数Syn和CgA阳性细胞为 “封闭型”的内分泌细胞。其与Lai等［4］研究结果相似，提示SCGN与传统神经内分泌标记物所显示的阳性细胞在种类上的差别。

WHO2000年消化系统肿瘤将胃肠道神经内分泌肿瘤分为高分化神经内分泌肿瘤即典型类癌，高分化神经内分泌癌即非典型类癌，差分化神经内分泌癌即小细胞癌，混合性外分泌－内分泌癌以及瘤样病变［8］共五类。

典型类癌细胞中度以下异型，核分裂像小于2个／10HPF（high power field，HPF即高倍视野），一般无坏死，瘤体一般不超过1cm，无局部浸润及转移；非典型类癌细胞中度及中度以上异型，核分裂像2-10个／10HPF，可见坏死，肿瘤侵入肠壁肌层或有淋巴结／肝脏转移；混合性外分泌－内分泌癌中神经内分泌癌和腺癌混合存在，两种成分比例均要超过30%。而对于神经内分泌癌或腺癌其中一种成分比例少于30%，WHO2000年分类中并未界定其应该归类为神经内分泌肿瘤，还是腺癌。因此对于胃肠道腺癌伴有局灶（少于30%）神经内分泌分化的肿瘤，将其归入腺癌或是神经内分泌肿瘤，目前尚存争议［9］。但公认的是神经内分泌肿瘤可有共同的形态学特点如器官样、栅栏状或小梁状排列，且均可不同程度的表达神经内分泌标记物。因此充分借助免疫组化进行及时准确的诊断和鉴别诊断就显得十分必要。

PGP9.5是一种分子量为27kDa的神经元特异性蛋白质，为神经内分泌肿瘤的标志物。但有关报道显示PGP9.5不仅在神经内分泌肿瘤细胞表达，也可在胃肠道上皮源性肿瘤细胞中表达［10］。CD56可表达于神经内分泌肿瘤，尤其对肺小细胞癌的诊断很有帮助［11］，但其尚与自然杀伤细胞、鳞状细胞癌、腺癌、间皮瘤等存在广泛的免疫交叉反应，即与NSE相似可表达于非神经内分泌肿瘤［12］。本实验显示CD56和NSE各在1例腺癌中有阳性表达，同时PGP9.5、CD56和NSE在类癌、非典型类癌及腺癌伴神经内分泌分化各组之间的表达均相对较低且无统计学差异（P＞0.05）。提示三者不仅特异性相对较差，而且阳性率相对较低，因此对神经内分泌肿瘤的诊断及鉴别诊断价值有限。

与相关报 道 相 似［4－5］，本 研 究 证 实SCGN 与 目前公认的最常用的神经内分泌标记物Syn和CgA［13］一样，在类癌、非典型类癌和腺癌伴神经内分泌分化区域较PGP9.5、CD56和NSE均有较高表达，且三者在这三类肿瘤中的阳性表达率均明显高于腺癌（P＜0.01），同时三者在类癌、非典型类癌中的阳性表达率均高于腺癌伴神经内分泌分化（P＜0.05）。提示SCGN、Syn和CgA在借助免疫组化诊断类癌和非典型类癌中的重要作用，以及在类癌和非典型类癌与腺癌、腺癌伴神经内分泌分化鉴别诊断中的重要价值。但是三者在类癌和非典型类癌之间的阳性表达率却均无统计学差异（P＞0.05），提示三者对类癌和非典型类癌无鉴别诊断意义。

总之，本研究证实SCGN可作为一种新型的神经内分泌标记物用于胃肠道类癌、非典型类癌和腺癌伴神经内分泌分化的临床病理诊断，推荐选择SCGN、Syn和CgA免疫标记组合。同时需要注意的是，仅依靠SCGN等神经内分泌标记物对鉴别胃肠道类癌和非典型类癌并无帮助，故还应结合形态学如细胞异型性、核分裂像、坏死、浸润及转移等特征综合考虑。

［1］Wagner L，Templ E，Reining G，et al.Culture of human insulinoma cells：development of a neuroendocrine tumour celland human pancreatic islet cell-specific monoclonal antibody.Endocrinol，1998，156（3）：469-476

［2］Wagner L，Oliyarnyk O，Gartner W，et al.Cloning and expression of secretagogin，a novel neuroendocrine and pancreatic islet of Langerhans-specific Ca2＋-binding protein.Biol Chem，2000，275（32）：24740-24751

［3］于萍，步宏，王华，等.免疫组化结果的图像分析与人工计数方法的对比研究.生物医学工程学杂志，2003，20（2）：288-290

［4］Lai MD，Lu BJ，Xing XM，et al.Secretagogin is a novel neuroendocrine marker，has a distinct expression pattern from chromogranin A.Virchows Arch，2006，449（4）：402-409

［5］林万润，刘雯，马金龙，等.Secretagogin在神经内分泌肿瘤组织的表达.中国现代普通外科进展，2009，12（6）：481-484

［6］Rogstam A，Linse S，Lindqvist A，et al.Binding of calcium ions and SNAP-25to the hexa EF-hand protein secretagogin.Biochem，2007，401（1）：353-363

［7］Bauer MC，O＇Connell DJ，Maj M，et al.Identification of a high-affinity network of secretagogin-binding proteins involved in vesicle secretion.Mol Biosyst，2011，7（7）：2196-2204

［8］Hamilton SR，Aaltonen LA.World Health Organization Classification of tumours，Pathology and Genetics of Tumours of the Digestive System.Lyon：IARC Press，2000，53-58

［9］Volante M，Rindi G，Papotti M.The grey zone between pure （neuro）endocrine and non-（neuro）endocrine tumours：a comment on concepts and classification of mixed exocrine-endocrine neoplasms.Virchows Arch，2006，449（5）：499-506

［10］Yamashita K，Park HL，Kim MS，et al.PGP9.5methylation in diffuse-type gastric cancer.Cancer Res，2006，66（7）：3921-3927

［11］王银萍，曲丽梅，郝玉丹.肺小细胞癌支气管镜活检的陷阱－附64例免疫组化研究.中国肺癌杂志，2009，12（8）：901-904

［12］张青云，徐建军，王雅明.人神经元特异性烯醇化酶在肿瘤细胞系中的表达检测及意义.中华检验医学杂志，2005，28（7）：728-731

［13］Modlin IM，Gustafsson BI，Moss SF，et al.Chromogranin A biological function and clinical utility in neuroendocrine tumor disease.Ann Surg Oncol，2010，17（9）：2427-2443

图 版 说 明

图1 SCGN在正常胃粘膜固有层腺体的表达多为“开放型”神经内分泌细胞，少数为“封闭型”。SP两步法 ×400

图2 Syn在正常胃粘膜固有层腺体的表达几乎均为“封闭型”神经内分泌细胞，仅见个别“开放型”细胞。SP两步法 ×400

图3 SCGN在胃腺癌伴神经内分泌分化细胞表达，而腺癌细胞不表达。SP两步法

图4 SCGN在直肠非典型类癌中的阳性表达。SP两步法

图5 SCGN在十二指肠类癌中强阳性表达。SP两步法 ×100

图6 PGP9.5在十二指肠类癌中无表达。SP两步法 ×100

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1Most of SCGN expression cells were so called “open”neuroendocrine cells in lamina propria of normal gastric mucosa gland，but a few “close”cells.SP method×400

Fig.2Most of Syn expression cells were so called “close”neuroendocrine cells in lamina propria of normal gastric mucosa，but rare“open”cells.SP method×400

Fig.3SCGN expression was positive in focal neuroendocrine differentiation cells of adenocarcinoma，but not in gastric adenocarcinoma cells.SP method

Fig.4SCGN expression was positive in rectal atypical carcinoid.SP method

Fig.5SCGN expression was diffusely positive in duodenal carcinoid.SP method×100

Fig.6PGP9.5expression was negtive in duodenal carcinoid.SP method×100