可溶性B7-H4在早期胃癌中的诊断价值探讨①

2012-02-05华建江杨庆伟徐志康梁巧玲

中国免疫学杂志 2012年8期

关键词：正常人灵敏度可溶性

华建江陈望姜健杨庆伟徐志康梁巧玲

(广州医学院附属深圳沙井医院检验科，深圳518104)

可溶性B7-H4在早期胃癌中的诊断价值探讨①

华建江陈望姜健②杨庆伟徐志康梁巧玲

(广州医学院附属深圳沙井医院检验科，深圳518104)

目的:探讨可溶性B7-H4(soluble B7-H4，sB7-H4)在早期胃癌中的诊断价值。方法:应用酶联免疫吸附试验(ELISA)夹心法检测80例早期胃癌患者与50例正常人血清sB7-H4水平，用化学发光法检测血清CEA、CA19-9水平，利用受试者工作特性曲线(ROC)，比较分析sB7-H4作为早期胃癌血清标志物的诊断价值。结果:早期胃癌患者血清sB7-H4水平(47.61 ±13.57)ng/ml明显高于正常人(30.62 ±8.65)ng/ml，差异有统计学意义(P ＜0.01)。sB7-H4 在早期胃癌诊断中的灵敏度(81.25%)和准确性(78.46%)均高于CEA及CA19-9，特异性(74%)低于CEA及A199。结论:sB7-H4在早期胃癌诊断中具有良好的临床应用前景，联合检测sB7-H4、CEA和CA19-9可提高胃癌的诊断率。

胃癌;B7-H4;ELISA;受试者工作特性曲线

胃癌是死亡率最高的恶性肿瘤之一，早诊断、早治疗是提高胃癌生存率的最有效手段。目前临床常用的血清标志物CEA、CA19-9的特异性和灵敏度较低，被认为缺乏早期诊断价值[1]。B7-H4是最新发现的B7家族成员，它在抗原特异性的免疫反应中起到非常重要的调节作用[2，3]。利用免疫组织化学染色方法，业已发现B7-H4在各种肿瘤组织中均有过度表达，如结肠癌、乳腺癌、卵巢癌等。B7-H4可表达于肿瘤细胞的胞膜上和胞浆内，还可以可溶性形式存在于血清中，且有实验证明了宫颈癌、食管癌患者血清中可溶性B7-H4(sB7-H4)水平的增高[4，5]。本研究用双抗体 ELISA 夹心法[6]，定量检测早期胃癌患者血清中 sB7-H4水平，比较分析sB7-H4与CEA、CA19-9在灵敏度、特异性、准确度上的差异，探讨sB7-H4在早期胃癌诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 80例早期胃癌(均经临床诊断和病理诊断确诊)标本来自2008年6月至2011年12月广州医学院附属深圳沙井医院肿瘤科和普外科的住院和门诊患者，其中男49例，女31例，年龄17～84岁。正常人50例，均为经本院体检健康的志愿者，其中男32例，女18例，年龄22～71岁。

1.2 试剂和仪器酶联微量反应板(Cloning公司)，抗人B7-H4单克隆抗体(eBioscience公司)，兔抗小鼠B7-H4多克隆抗体(由广东医学院临床免疫学教研室制备)，HRP标记羊抗兔IgG(北京博奥森生物技术有限公司)，TMB底物及显色剂(沈阳惠民公司)。癌胚抗原(CEA)、糖链抗原19-9(CA19-9) (美国贝克曼原装试剂)。BOTEK Elx800型酶标仪，ACCESS2化学发光仪等。

1.3 双抗体夹心ELISA法检测可溶性B7-H4双抗体夹心ELISA法的建立参见文献[6]。采用抗人B7-H4 mAb包被酶标板，FCS封闭。在包被好的酶标板中加入待测血清标本，用重组小鼠B7-H4蛋白作为参考标准品，37℃作用1小时，加入稀释的兔抗小鼠B7-H4多克隆抗体，用PBST洗3次，再加入HRP标记羊抗兔IgG，加显色底物，以硫酸终止反应，在酶标仪上测A450值。利用标准曲线法计算未知样品的浓度。

1.4 标本收集和检测所有患者和正常人在早上空腹采血，分离血清后放－70℃保存。采用上述建立的ELISA法对所有样本在同一批内进行检测，每个样本设立两个平行孔，取平均A值计算样本中sB7-H4的含量(ng/ml)，同时上机检测所有患者和正常人血清CEA、CA19-9含量。

1.5 统计学处理采用SPSS17.0统计软件对数据进行统计学分析，数值用±s表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 早期胃癌患者和正常人血清 sB7-H4、CEA、CA19-9水平与正常人相比，早期胃癌患者血清中sB7-H4、CEA、CA19-9水平均显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)，该结果提示，sB7-H4在胃癌早期诊断中具有潜在应用的价值。

2.2 sB7-H4与 CEA、CA19-9相关性分析将80例早期胃癌患者血清 sB7-H4水平分别与 CEA、CA19-9水平进行单因素直线相关分析，结果显示sB7-H4与 CEA、CA19-9均呈正相关(r分别为0.496 和0.506，P 均＜0.01)。

表1 胃癌患者和正常人三种血清标记物水平比较(±s)Tab.1 The comparison of three kinds of serum marker levels in early gastric cancer patients and normal people(±s)

Note:There was significant difference between early gastric cancer patients and normal people，1)P ＜0.01.

Groups nsB7-H4(ng/ml)CEA(ng/ml)CA19-9(IU/L) Early gastric Cancer patients 80 47.61 ±13.57 10.38 ±7.54 40.88 ±20.79 Normal people50 30.62 ±8.651)3.71 ±2.121)23.83 ±16.541)

2.3 早期胃癌患者血清sB7-H4、CEA、CA19-9曲线下面积比较利用受试者工作特性曲线(ROC)测得sB7-H4对应产生的曲线下面积(AUC)为0.857 (95%可信区间为0.793～0.921)，大于 CEA 的0.734(95%可信区间为0.646～0.821)和CA19～9的0.805(95%可信区间为0.728 ～0.881)，如图1。

2.4 早期胃癌患者血清sB7-H4、CEA、CA19-9诊断效率比较(%) 通过ROC曲线分析，sB7-H4的最佳诊断值为34.71 ng/ml，它在早期胃癌诊断中的灵敏度(81.25%)和准确性(78.46%)均高于CEA及CA19-9，特异性(74%)低于 CEA及 A199，CEA和CA19-9单项检测时的阳性率都比较低，而联合检测sB7-H4、CEA和CA19-9可将早期胃癌的诊断率提高至90%。

图1 早期胃癌患者血清sB7-H4、CEA、CA19-9曲线下面积比较Fig.1 The comparison of the area under the curve (AUC)of sB7-H4，CEA and CA19-9 in early gastric cancer patients

表2sB7-H4、CEA、CA19-9诊断效率比较(%)Tab.2 The comparison of diagnostic efficiency of sB7-H4，CEA and CA19-9 in early gastric cancer patients (%)

3 讨论

胃癌的发病率及死亡率始终居消化系统恶性肿瘤之前列，目前胃癌诊断后的5年生存率仍低于20%。胃癌早期症状不明显，且缺乏有效的普查方法，84.5% 的胃癌患者就诊时已处于中、晚期[7]。因此，寻找新的分子标志物依然是胃癌诊断和治疗的研究热点之一。

目前，国内有关B7-H4与肿瘤关系的研究越来越多，已证实大多数肿瘤组织均高表达B7-H4，如前列腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌等等[8-10]，几乎涵盖了肿瘤的各个领域。众多的研究表明，B7-H4在肿瘤的发生、发展及预后有重要作用，可为肿瘤的诊断和治疗提供一种新的靶位点，具有良好的临床应用前景。然而，目前对B7-H4的研究大多采用Western blot和免疫组织化学染色的方法，操作繁锁，只能定性研究B7-H4在肿瘤组织中表达情况，难比较手术前后病人B7-H4含量的变化。Simon等[11]在2006年发现了以可溶性形式存在于血清中的B7-H4(sB7-H4)，且显示了sB7-H4辅助CA125诊断卵巢癌的优越性。

本项目用前期研究中建立的双抗体夹心ELISA法，定量检测80例早期胃癌患者血清中sB7-H4水平，同时与消化系统恶性肿瘤常用的辅助诊断指标CEA、CA19-9作对比，比较分析三者在灵敏度、特异性、准确度上的差异，以探讨sB7-H4在早期胃癌诊断中的价值。结果发现，胃癌患者血清sB7-H4水平明显高于正常人，差异有统计学意义(P＜0.01)。直线相关分析显示，sB7-H4与CEA、CA19-9均呈正相关，提示sB7-H4初步具备胃癌血清标志物的潜质。利用受试者工作特性曲线(ROC)测得sB7-H4对应产生的曲线下面积(AUC)为0.857，大于CEA的0.734 和 CA19-9 的 0.805，与 Simon 等[11]测得sB7-H4在卵巢癌对应的曲线下面积(0.86)结果较一致。此结果说明，虽然三者在早期胃癌的诊断中均有一定的准确性，但sB7-H4的准确性要稍高于CA19-9和CEA。据报道，血清CEA检测对胃癌的灵敏度为33.3% ～70.4%，特异性为83.5% ～85.7%[12，13]，血清 CA19-9 的灵敏度为 18.75% ～60%，特异度为 80% ～85%[12-15]，本研究测得 CEA和CA19-9的灵敏度较低，分别为38.75%、45%，这可能是CEA和CA19-9被认为缺乏早期诊断价值的原因。sB7-H4的灵敏度、准确度分别为81.25%、78.46%，均明显高于CEA和CA19-9，而特异度仅为74%，低于 CEA的 80%和 CA19-9的92%，提示sB7-H可能是一个广谱的肿瘤标志物。尽管三种血清标志物均具有一定的诊断价值，但sB7-H4的诊断效率要高于CEA和CA19-9。CEA和CA19-9单项检测时的阳性率都比较低，而联合检测sB7-H4、CEA和CA19-9可将早期胃癌的诊断率提高至90%。因为肿瘤的发生是多基因、多步骤改变的结果，也是多靶点、多环节的调控过程，联合检测正成为该领域一个重要的探索方向，能弥补单项检测的不足，可明显提高早期胃癌的诊断率。

综上所述，本研究表明sB7-H4在早期胃癌诊断中具有良好的临床应用前景，但尚需做以下的基础研究进一步证实:(1)目前对于B7-H4的受体及其信号转导途径尚未明确[16]，尚不清楚sB7-H4来源于何处，以及sB7-H4能在多大程度上代表体内总的B7-H4含量;(2)对B7-H4分子表达的调控机制有待进一步明确。

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[收稿2011-11-20 修回2012-04-20]
(编辑许四平)

The research on diagnosis value of soluble B7-H4 in early gastric cancer

HUA Jian-Jiang，CHEN Wang，JIANG Jian，YANG Qing-Wei，XU ZHi-Kang，LIANG Qiao-Ling.Department of Laboratory Medicine，Shenzhen Shajing Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Shenzhen 518104，China

Objective:To discuss the diagnosis value of soluble B7-H4(sB7-H4)in early gastric cancer.MethodsUsing ELISA sandwich method，the serum level of soluble B7-H4 was detected in 80 cases of early gastric cancer patients and 50 cases of normal people，Chemiluminescence method was adopted to determine the serum CEA and CA19-9 levels ，then analyzed the diagnosis value of sB7-H4 in early gastric cancer with ROC(Receiver Operating Characteristic).ResultsThe serum level of soluble B7-H4 in early gastric cancer patients [(47.61 ±13.57)ng/ml]was significantly higher than that in normal people[(30.62 ±8.65)ng/ml]，there was significant difference within them(P ＜0.01).The sensitivity(81.25%)and accuracy(78.46%)of sB7-H4 in early gastric cancer was higher than CEA and CA19-9，but the specificity(74%)was lower than CEA and CA19-9.ConclusionSoluble B7-H4 have good prospects in clinical application on diagnosing early gastric cancer，detecting the serum levels of sB7-H4，together with CEA and CA19-9 can raise the positive rate of early gastric cancer.

Gastric neoplasms;B7-H4;ELISA;Receiver Operating Characteristic(ROC)

R735.2

1000-484X(2012)08-0745-03

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.016①本文为深圳市科技计划项目(No.200803231)和深圳市宝安区科技计划项目(No.2008174)

②深圳市福田区中医院检验科，深圳518000

华建江(1973年－)，男，硕士，副主任技师，主要从事血液疾病检验方面的研究。