TWIST、HIF-1α、VEGF在胃癌中的表达及意义①

孙景洲 金光玉 陈友权 张玉荣 盛文文 (皖西卫生职业学院病理学教研室，六安237000)

TWIST、HIF-1α、VEGF在胃癌中的表达及意义①

孙景洲 金光玉 陈友权 张玉荣 盛文文 (皖西卫生职业学院病理学教研室，六安237000)

目的:探讨TWIST，HIF-1α和VEGF在人胃癌组织中的表达及与临床病理参数、预后的关系。方法:选择120例胃癌标本，应用SP法免疫组化检测TWIST、HIF-1α和VEGF在人胃癌组织中的表达，分析TWIST、HIF-1α和VEGF的表达与患者临床病理参数之间的关系。结果:胃癌组织及正常胃黏膜组织中均可检测到TWIST、HIF-1α和VEGF的表达，但胃癌组织中的表达水平均明显高于正常胃黏膜组织，表达差异有显著性(P＜0.05)。TWIST的表达与浸润深度、肿瘤远处转移及淋巴结转移明显相关(P＜0.05)。HIF-1α的表达与肿瘤的分化程度、浸润深度及淋巴结转移呈明显相关性(P＜0.05)。VEGF的阳性表达与浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关(P＜0.05)。TWIST和(或)HIF-1α阳性表达的患者其5年生存率明显低于其阴性表达的患者。结论:胃癌中TWIST、HIF-1α和VEGF的高表达与胃癌的生物学行为及预后密切相关，检测其表达对预测胃癌的转移及判断预后有一定价值。

胃癌;TWIST;HIF-1α;VEGF

实体肿瘤快速生长时，肿瘤细胞微环境缺氧是其共同特征。在缺氧微环境下，肿瘤细胞高表达缺氧诱导因子-1α[1](Hypoxia induced factor，HIF-1α)，肿瘤细胞在长期缺氧微环境刺激下，通过HIF-1α表达增高调控血管新生(如VEGF、TGF等)，促进细胞发生上皮间质转化(如TWIST、E-cadherin等)等途径适应缺氧微环境而促进肿瘤生长和转移[2]。本研究拟运用免疫组织化学的方法，检测HIF-1α、上皮间质转化相关因子TWIST以及血管内皮生长因子VEGF在胃癌中的表达，并探讨它们与胃癌生物学行为的关系，为临床防治胃癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 组织标本取自2005年1月～2006年12月安徽医科大学第一附属医院外科胃腺癌切除术标本120例，患者术前均未接受化疗及放疗。术后均经病理医师就所调取的切片重新阅片，并分级分期。其中男67例，女53例，年龄34～81岁，中位56岁，胃癌淋巴结转移77例。所有胃癌按WHO胃癌组织学分级及分类如下:1)分化类型:低分化71例，中高分化49例;2)浸润深度:至浆膜下81例，未浸润至浆膜39例;3)大小:直径小于5 cm有45例，大于5 cm有75例;4)TNM分期:Ⅰ+Ⅱ33例，Ⅲ+Ⅳ87例。每例以相应的癌旁正常组织作为对照组。

1.2 主要试剂和方法

1.2.1 试剂 TWIST抗体、HIF-1α抗体、VEGF抗体、SP试剂盒、DAB染色剂均购于北京中杉公司。

1.2.2 方法 切片常规脱蜡至化水。PBS洗3次/ 5分钟;3%H2O2滴加在组织上，室温静置10分钟，封闭内源性过氧化氢酶，PBS洗3次/5分钟。抗原修复。滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。滴加Ⅰ抗，4℃过夜。PBS洗3次/5分钟。滴加二抗，37℃ 20分钟。PBS洗3次每次5分钟。滴加试剂SABC，37℃ 20分钟。PBS洗3次每次5分钟。DAB显色。蒸馏水洗。苏木素复染1分钟。脱水、透明、封片、镜检。

1.3 结果判断 HIF-1α、TWIST和VEGF蛋白均定位在以胞质为主，以细胞呈棕色或棕褐色为阳性标准。每例切片选择10个高倍镜视野(×40)，阴性标准为阳性细胞数占视野总细胞数小于25%，阳性标准为阳性细胞数占视野总细胞数大于等于25%[3]。

1.4 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件。多组数据阳性率的比较采用χ2检验;参数间的相关性用Spearman等级相关分析。

2 结果

2.1 TWIST、HIF-1α及VEGF在胃癌组织中的表达 TWIST阳性染色主要位于细胞质中，少数细胞核中也有表达(图1)，HIF-1α蛋白表达在胞质或胞核(图2)，VEGF蛋白表达在胞质(图3);TWIST、HIF-1α及VEGF在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 TWIST、HIF-1α及VEGF的表达与胃癌临床病理参数的关系 统计学分析结果表明:TWIST的表达与浸润深度、肿瘤远处转移及淋巴结转移明显相关。HIF-1α的表达与肿瘤的分化程度、浸润深度及淋巴结转移呈明显相关性。VEGF的阳性表达与浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关(见表1)。

2.3 胃癌中TWIST、HIF-1α分别与VEGF表达之间的相关性 Spearman等级相关分析显示，TWIST与VEGF之间呈正相关性(χ2=9.605，P ＜0.05);HIF-1α 与 VEGF 之间呈正相关性(χ2=11.10，P ＜0.05)。

2.4 TWIST、HIF-1α蛋白的表达与胃癌患者生存率的关系 在以上工作的基础上，本课题组对120例患者的5年生存率进行了随访和统计学分析。结果表明TWIST阳性表达的患者其5年生存率明显低于阴性表达的患者(13.1%vs 42.3%，双侧logrank检验，P﹤0.05);HIF-1α表达阳性患者的5年生存率也显著低于其阴性表达者(15.2%vs 37.5%，双侧log-rank检验，P﹤0.05)。

图1 胃癌中TWIST阳性表达(SABC，×400)Fig.1 Expression of TWIST in GC(SABC，×400)

图2 胃癌中HIF-1α阳性表达(SABC，×400)Fig.2 Expression of HIF-1α in GC(SABC，×400)

图3 胃癌中VEGF阳性表达(SABC，×400)Fig.3 Expression of VEGF in GC(SABC，×400)

表1 TWIST、HIF-1α及VEGF的表达与胃癌临床病理参数的关系Tab.1 The relationship between the expression of TWIST，HIF-1α and VEGF clinic pathological parameters of gastric cancer

3 讨论

缺氧环境是肿瘤发生浸润转移的重要因素之一。HIF-1α是主要的氧调节亚基，也是调节肿瘤细胞适应低氧的关键转录激活因子，可以诱导多基因表达，抑制肿瘤血管生成，从而促进肿瘤发生浸润和转移[4]。本实验结果也表明HIF-1α的表达与肿瘤的分化程度、浸润深度及淋巴结转移呈明显相关性，并且HIF-1α表达阳性患者的5年生存率也显著低于其阴性表达者。有多项研究发现HIF-1α在胃癌、卵巢癌等多种肿瘤中高表达，并且与肿瘤的生物学行为密切相关[5，6]。

Yang等[7]研究发现 HIF-1α是肿瘤细胞上皮间质转化的关键因子之一，可以直接促进其相关因子TWIST的表达。在缺氧环境中TWIST可以抑制上皮表型E-cad表达，促进间质表型N-cad的表达，从而诱导上皮间质转化现象的发生。多项研究发现在舌鳞癌、乳腺癌中TWIST的高表达与患者的预后显著相关[8，9]。本研究发现，胃癌组织中TWIST蛋白的表达水平显著高于正常胃黏膜组织，TWIST的表达与肿瘤远处转移、淋巴结转移及浸润深度明显相关，提示TWIST蛋白可以为胃癌及非胃癌的鉴别提供参考，对肿瘤的恶性程度及预后做出判断和预测。此外，我们还发现TWIST蛋白表达与VEGF蛋白表达密切相关，提示TWIST在血管生成过程中发挥了一定的作用，这与Niu等人[10]的研究结果是一致的。

Liu等[11]证实 HIF-1α 促进 VEGF mRNA 的稳定表达。本实验结果表明，VEGF阳性表达率随着肿瘤分化程度的降低逐渐升高，且随着肿瘤浸润越深、淋巴结转移以及TNM分期的增加，其VEGF阳性表达率也逐渐升高，说明VEGF的高表达与胃癌的恶性行为及不良预后有着密切的关系。

肿瘤生长迅速，体积不断增大，细胞增殖需要大量耗氧，因此缺氧是实体肿瘤发展过程中的普遍现象。缺氧环境诱导HIF-1α高表达，从而促进肿瘤细胞分泌VEGF，促进血管生成[12]。同时HIF-1α上调TWIST的表达，诱导细胞发生上皮间质转化，肿瘤细胞获得恶性表型[13]。因此研究 TWIST、HIF-1α 及VEGF在胃癌中的表达，可能对临床评价胃癌侵袭、转移能力提供参考。本研究发现胃癌组织TWIST、HIF-1α及VEGF均呈高表达，TWIST、HIF-1α的表达均与VEGF的表达呈正相关性，提示TWIST、HIF-1α及VEGF参与了胃癌的进展、浸润、转移等过程，联合检测TWIST、HIF-1α及VEGF在胃癌中的表达，对预测胃癌的转移及判断预后有一定价值。

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5 Huang C，Sun Z，Sun Y et al.Association of increased ligand cyclophilin A and receptor CD147 with hypoxia，angiogenesis，metastasis and prognosis of tongue squamous cell carcinoma[J].Histopathology，2012;60(5):793-803.

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10 Niu R F，Zhang L，Xi G M et al.Up-regulation of TWIST induces angiogenesis and correlates with metastasis in hepatocellular carcinoma[J].J Exp Clin Cancer Res，2007;26(3):385-394.

11 Liu L X ，Lu H ，Luo Y et al.Stablization of vascular endothelial growth factor mRNA by hypoxia inducible factor[J].BiochmBiophys Res immune ，2002;291(4):908-914.

12.张洪珍 ，赵建晖 ，赵晓晖.缺氧对食管癌Eca109细胞系HIF-1α和VEGF表达及放射敏感性的影响[J].河北医科大学学报，2008;29(6):815-818.

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[收稿2012-03-21 修回2012-04-20]

(编辑 张晓舟)

Expression of TWIST，HIF-1α and VEGF in gastric cancer and their significance

SUN Jing-Zhou，JIN Guang-Yu，CHEN You-Quan，ZHANG Yu-Rong，SHENG Wen-Wen.Department of Pathology，West Anhui Health Vocational College，Liuan 237000，China

Objective:To investigate the relationship between the expressions of TWIST ，HIF-1α，VEGF and their clinical pathological parameters in gastric carcinoma.Explore their significances in judging the prognosis of patients.MethodsImmuohistochemistry was used to detect the expressions of TWIST，HIF-1α and VEGF in 120 cases of gastric carcinoma specimens and corresponding adjacent normal tissue.ResultsTWIST，HIF-1α and VEGF expression could be detected in gastric cancer tissues and normal gastric mucosa，but expression in gastric cancer tissues was significantly higher than in normal gastric mucosa，expression differences were significant(P ＜0.05).Patients with TWIST positive expression showed higher incidence of lymph node metastasis(P ＜0.05) and distant metastasis(P ＜0.05)than those with TWIST negative expression.HIF-1α expression was closely correlated with tumor histological type，depth of invasion，lymph node metastasis(P ＜0.05).The expression of VEGF was significant related with depth of invasion，lymph node metastasis and TNM stage(P ＜0.05).Patients with high expressions of TWIST and(or)HIF-1 α had lower five-year survival rate than patients with negative expression.ConclusionThe expressions of TWIST，HIF-1 α and VEGF were closely related to the biological characteristics in gastric carcinoma.It is valuable to detect their expressions for the prediction of gastric carcinoma and judgment of prognosis.

Gastric cancer;TWIST;HIF-1α;VEGF

R735.2

A

1000-484X(2012)08-0748-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.017

①本文为安徽省高等学校省级自然科学研究项目(KJ2012B210)

孙景洲(1959年－)，男，副教授，教研室主任，主要从事消化系统肿瘤研究，E-mail:289843592@qq.com。