不同民族大学生乙肝病毒基因型分布状况调查

李 劲，刘 莹，邓志芳，胡文娟，高 奎，赵瑞杰，王 红，宋发军，*

(1中南民族大学生命科学学院，武汉430074;2中南民族大学校医院，武汉430074)

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起并以肝脏炎性病变为主和多器官损害的一种危害严重的传染性疾病.由于对HBV基因分型较蛋白质水平上的血清分型更准确，不同基因型的HBV感染患者在临床病程和治疗反应存在一定差异［1］，故分型有利于深入细致地研究HBV感染的流行病学、病因学和临床诊治.为分析乙肝病毒的基因分型和自然变异状况，本研究采用改良的快速限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术对中南民族大学2008级93例15个民族乙肝大三阳患者HBV基因分型，为HBV的预防和治疗提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象

所有血清标本来自中南民族大学2008级93例乙肝大三阳患者，HBsAg表面抗原阳性.其中男性56例，女性37例.

1.2 方法

1.2.1 引物设计和限制酶筛选

根据 GenBank 数据库(http://www.nvbi.nlm.nih.gov/)查取HBV的S区核苷酸序列，并参考文献［2］，设计引物及筛选限制性内切酶，分别见表1和表2.PCR扩增时先采用外引物扩增得HBV的DNA长片段(1017 bp)，再用内引物扩增得目的片段(585 bp).

表1 引物设计Tab.1 Design of Primer sequence

表2 乙肝分型限制酶的选择Tab.2 Restriction enzymes for indentification of HBV genotypes

1.2.2 HBV 的 DNA 提取

取50μL乙肝大三阳患者血清于1.5mL Ep管中，沸水浴10min后，冷却至室温，14000r/min离心5min，上清为模板用于PCR扩增.

1.2.3 半巢式PCR扩增

参照说明书配置PCR体系，总体积25μL，含无菌水17.5 μL，10 × buffer 2.5 μL，10 μmol/L 正反向引物各0.5 μL，1 mmol/L dNTP 1.5 μL，0.25 U/μL Tag聚合酶1.5μL，乙肝病毒DNA模板1μL.

经梯度PCR后确定最优半巢式PCR程序:94℃5min;94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 45s，30 个循环;72℃ 5min;4℃ 2h.1%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，凝胶成像仪拍照.

1.2.4 限制性内切酶酶切

按照限制酶产品说明书体系和要求进行酶切.酶切顺序为BsrI→StyI→DpnI→HpaII.

1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳法对基因分型的检测

聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，以1×TBE为电解液，电压15V/cm.电泳完成后EB染色，凝胶成像仪拍照，记录基因分型情况.

1.2.6 统计学分析

利用SPSS17.0软件对HBV各基因型所占比例进行χ2检验.

2 结果与分析

2.1 半巢式PCR产物凝胶电泳

煮沸法提取HBV DNA基因组产量较少，无法用琼脂糖凝胶电泳检测，故直接进行PCR.基因组S区扩增产物经琼脂糖凝胶电泳结果见图1.由图1可见，半巢式PCR产物均为585bp，DNA带型整齐亮度清晰，除100bp以下引物二聚体外，无明显非特异杂带，表示PCR扩增效果好，产物特异。

图1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR production

2.2 HBV 基因分型

PCR产物酶切后经聚丙烯酰胺凝胶电泳，HBV基因分型结果见图2.由图2可见，PCR产物经BsrI酶切为126和459bp，可判断为B1型;经BsrI酶切为126，184和275bp，而无法被HpaII酶切的可判断为B2型;无法被BsrI酶切，而被StyI酶切为253和332bp的可判断为 C1型;被BsrI酶切为 285，300bp，而无法被DpnI酶切的可判断为D3型.另外，经BsrI、StyI、DpnI、HpaII酶切，条带均为 585bp 无法进行分型(暂定为C2或D2型)，共8例.未发现除B、C、D外的HBV其他基因型.

图 2 Bsr I、Sty I、Dpn I、Hpa II酶切 HBV 分型图Fig.2 Diagram of HBV Genotype by Bsr I、Sty I、Dpn I、Hpa II

2.3 93例15个民族乙肝大学生HBV基因型分布

不同民族乙肝大三阳学生的HBV基因型分布见表4.由表4可见，93例大学生中B型占61.3%(57/93)，C 型占 25.8%(24/93)，D 型占 4.3%(4/93).经χ2检验，B型所占比例在汉族和少数民族中均最多，C型次之，D型最少(B型和C型相比，χ2=8.7016，P=0.0032;B 型和 D 型相比，χ2=34.5516，P＜0.0001;C 型和 D 型相比，χ2=11.1263，P=0.0009).汉族的乙肝大学生中主要以B型为主(31例);少数民族中B型也较多共26例，其中壮族6例，瑶族3例，土家族3例，畲族5例，苗族2例，回族、仡佬族、毛南族、满族、侗族、布依族、白族各1例.C型在汉族和少数民族中均较少，其中汉族13例，壮族7例，土家族、回族、黎族、蒙古族各1例;D型最少，汉族2例，壮族和黎族各1例.此外，汉族和少数民族的HBV基因B、C、D型无显著性差异(χ2=0.029，P=0.986)，说明不同民族不影响 HBV基因型的分布.

表4 93例15个民族HBV基因型分布Tab.4 Distribution of HBV genotypes of 93 samples from 15 nationalities

3 讨论

我国HBV主要以B型和C型为主，有一定的地域差异，北方以C型为主，南方以B型为主［3］.本研究中汉族、瑶族、土家族、畲族、苗族均以B型为主;仡佬族、毛南族、满族、侗族、布依族、白族样本少，但全部为B型;壮族、回族、黎族、蒙古族中B型和C型几乎均等，这符合我国北方城市以C型流行为主，由北至南，B型感染率逐渐增高的规律［4］.此外，壮族和黎族患者中各检测到一份D型，符合我国少数民族地区D型少见，而西北少数民族D型较其他少数民族多见的规律［5］.在93例乙肝大三阳患者中，男性56例，女性37例，男性感染率高于女性，与国内报道一致［6，7］，可能与男性生活卫生和自我保护意识较女性差有关.本实验中，汉族和壮族样本量基本能说明我国HBV分布规律，而其他少数民族患者样本偏少，仍需要增大样本量深入研究.

中国是乙肝的高发区，乙肝具有传播途径复杂，流行面广，感染率高的特点，严重危害人民的健康［8］.调查不同基因型的HBV在不同民族中的分布，可反映其在地域和人群流动性上的差异.HBV基因型与临床治疗效果和疾病发展密切相关［9］，治疗前明确患者基因型，有助于个体化制定抗病毒治疗方案，使疗效最优;而不同基因型在病原学、流行病学、人类学、临床治疗等方面的资料，为干扰素和其他药物治疗慢性乙型肝炎提供了研究线索.

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