银杏总黄酮对糖尿病大鼠心肌转化生长因子-β1表达的影响

张 翠 张根葆 朱海龙 (皖南医学院病理生理教研室，安徽 芜湖 241002)

银杏总黄酮对糖尿病大鼠心肌转化生长因子-β1表达的影响

张 翠 张根葆 朱海龙 (皖南医学院病理生理教研室，安徽 芜湖 241002)

目的探讨银杏总黄酮对糖尿病大鼠的抗氧化作用及对心肌转化生长因子(TGF)-β1表达的影响。方法SD大鼠随机分为:正常对照组、糖尿病模型组、银杏总黄酮组，采用腹腔注射链脲佐菌素(STE)法建立糖尿病大鼠模型，生化方法检测血糖，血及心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)的含量;ELISA法检测各组心肌TGF-β1水平;光镜观察心肌组织形态改变。结果与糖尿病模型组相比，银杏总黄酮组大鼠血糖水平明显降低，血清及心肌组织SOD活性升高，MDA含量显著降低，心肌组织TGF-β1蛋白水平与糖尿病模型组相比明显下降。结论银杏总黄酮能够减轻STZ诱导的糖尿病大鼠心肌氧化应激程度，降低心肌TGF-β1蛋白表达水平，对糖尿病心肌具有一定的保护作用。

银杏总黄酮;糖尿病心肌病;转化生长因子β1;氧化应激

研究证实，氧化应激启动并参与糖尿病心肌病(DCM)发生发展的各个环节〔1〕。银杏提取物主要有效成分为黄酮类和银杏内酯类生物活性物质，具有广泛的药用价值，其对心脑血管及多种疾病有确切治疗作用〔2〕。黄酮类化合物具有抗氧化、抑制α2葡萄糖苷酶、抗炎、抑制醛糖还原酶等作用，对糖尿病及其并发症具有一定的预防和治疗作用〔3〕，但银杏总黄酮对糖尿病心脏是否具有保护作用，文献报道较少。本实验探讨银杏总黄酮对DCM的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雌性SD大鼠28只，体重180～220 g，由南京青龙山动物养殖场提供。银杏叶总黄酮购自南京青泽医药有限公司;STZ购自Sigma公司;血糖检测试剂盒购自长春迪瑞实业有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、考马斯亮蓝检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，转化生长因子(TGF)-β1检测试剂盒(ELISA)购自美国RD公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立与分组 大鼠随机分为3组:正常对照组(8只):生理盐水2 m l/d灌胃;糖尿病模型组(10只):生理盐水2 ml/d灌胃;银杏总黄酮组(10只):银杏总黄酮250 mg·kg－1·d－1灌胃。糖尿病模型组和银杏总黄酮组大鼠禁食12 h后腹腔注射溶于无菌枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液(pH4.5)的STZ，用量为65 mg/kg，正常对照组注射等体积的无菌枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液，48 h后空腹尾静脉采血测血糖，血糖值≥13.8 mmol/L的大鼠视为糖尿病模型复制成功。

1.2.2 标本收集 模型复制成功30 d后处死各组大鼠，3%的戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠，颈动脉插管取血，4℃离心分离血清置－20℃保存。打开胸腔后，迅速整体取出心脏并放入冰生理盐水中漂洗，取心尖部组织置－80℃保存，用于检测心肌组织SOD活性、MDA含量及TGF-β1蛋白水平，余下部分于4%的中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，供形态学检测。

1.2.3 生化指标的检测 取少许心尖部组织在冰冷的生理盐水中漂洗，滤纸拭干，剪碎，放入匀浆器内，以预冷的生理盐水为匀浆介质，在冰上研磨制成10%组织匀浆，用低温低速离心机4 000 r/min，离心10 min，取上清液测定。应用羟胺法测血及心肌匀浆SOD活性，硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA含量，均严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.4 ELISA法检测血清及心肌TGF-β1水平 采用ELISA法测大鼠血和心肌TGF-β1水平，严格按试剂盒说明书检测。

1.2.5 形态学检测 心肌组织行石蜡切片，HE染色，光镜观察心肌组织形态学改变。

1.3 统计学处理 用SPSS12.0统计软件处理，数据用±s表示，两组间差异显著性比较用t检验。

2 结果

2.1 大鼠的一般状况 糖尿病模型组大鼠逐渐出现多饮、多食、多尿等典型的糖尿病表现，正常对照组饮水、进食量、尿量基本正常，精神状态良好，体重明显增加，银杏总黄酮治疗组大鼠多饮、多食、多尿现象均有一定改善。

2.2 银杏总黄酮对STZ诱导的糖尿病大鼠体重及血糖的影响由表1可知，与正常对照组相比，糖尿病模型组大鼠血糖明显升高，经银杏总黄酮治疗后，大鼠血糖水平与模型组相比显著降低;模型组大鼠体重与对照组相比显著下降，而银杏总黄酮治疗组体重有所增加。

2.3 银杏总黄酮对大鼠血清SOD活性、MDA含量的影响 糖尿病模型组大鼠血清SOD活性与正常对照组比较明显降低，MDA含量显著升高，而银杏总黄酮治疗组大鼠的SOD活性较糖尿病模型组有显著提高，与此相应，MDA含量明显下降。见表2。

2.4 银杏总黄酮对大鼠心肌组织SOD活性、MDA含量的影响从表2看出，糖尿病模型组大鼠心肌组织SOD活性与正常对照组比较明显降低，而MDA含量显著升高;银杏叶总黄酮治疗组大鼠心肌SOD活性较糖尿病模型组有显著提高;同时，MDA含量明显下降。

2.5 银杏总黄酮对大鼠血清及心肌组织TGF-β1表达的影响与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠血清及心肌组织

TGF-β1表达水平显著增高;而银杏总黄酮治疗组大鼠血清及心肌组织TGF-β1表达水平明显下降。见表2。

表1 银杏总黄酮对各组大鼠体重及血糖的影响(±s)

表1 银杏总黄酮对各组大鼠体重及血糖的影响(±s)

与正常对照组比较:1)P＜0.01;与糖尿病模型组比较:2)P＜0.05，3)P＜0.01

组别 n 体重(g)治疗前 治疗后 血糖(mmol/L)8 205.75±11.34 303.75 ±20.48 5.75±1.02糖尿病模型组 10 209.60±12.29 165.90±12.321)25.33±5.071)银杏总黄酮组 10 204.10 ±10.18 225.40±16.983)20.64±4.182)正常对照组

表2 银杏叶总黄酮对大鼠血清、心肌SOD活性、MDA含量、TGF-β1表达的影响(±s)

表2 银杏叶总黄酮对大鼠血清、心肌SOD活性、MDA含量、TGF-β1表达的影响(±s)

与正常对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与糖尿病模型组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01

组别 n 血清SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)心肌SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)TGF-β1血清(ng/L) 心肌(ng/L)0.30 12.70±2.21 50.18±12.40糖尿病模型组 10 99.47±16.181) 7.83±1.141) 218.06±43.911) 2.89±0.532) 21.86±4.251) 118.26±26.191)银杏总黄酮组 10 117.86±17.413) 6.52±1.193) 261.87±41.293) 2.42±0.413) 17.56±3.683) 90.17±15.994)正常对照组 8 138.48±22.14 4.78±0.77 283.12±68.93 1.59±

2.6 银杏总黄酮对大鼠心肌组织形态学的影响 正常对照组心肌细胞排列整齐，着色均匀，糖尿病模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，扭曲，心肌细胞肥大，空泡变性，并见局灶性心肌纤维溶解坏死，结构不清，银杏总黄酮治疗组病变与模型组相比明显减轻。见图1。

图1 各组心肌组织病理比较(HE，×400)

3 讨论

高血糖是DCM发生的关键环节，糖尿病血糖增高后能够启动多种有害因素，进而引起心肌纤维化和胶原沉积。多种黄酮类药物能降低糖尿病患者血糖水平〔4〕，本结果提示其在一定程度上能够改善糖尿病大鼠血糖水平，与以往报道相符。

研究发现，通过抗氧化剂抑制心肌细胞的死亡，可以明显阻止糖尿病的心脏毒性〔5〕，同时研究表明氧化应激在DCM的发病中起着重要作用，本研究结果提示总黄酮能够增强STZ诱导的糖尿病大鼠心肌抗氧化能力，降低心脏氧化应激水平，保护糖尿病心脏。

心肌间质胶原纤维沉积和心肌纤维化是DCM的一种特征性病理改变，致心室收缩及舒张功能不全，最终导致心力衰竭〔6〕。多种细胞因子参与其发病过程，其中TGF-β1是关键的致心肌纤维化因子，DM时的高血糖、AngⅡ及胰岛素抵抗等均可刺激TGF-β1分泌，增多后的TGF-β1能够通过受体刺激心脏成纤维细胞合成Ⅰ型、Ⅲ型胶原及纤维连接蛋白(FN)，增加心肌组织ECM含量，同时下调蛋白水解酶活性，抑制纤溶酶原、胶原酶原、基质酶原等酶原激活物的产生，减少胶原降解，增加心肌细胞外基质的含量，促进心肌纤维化〔7〕。以上研究均表明TGF-β1在DCM的发生发展过程中起到重要作用，因此，抑制心肌TGF-β1表达能够延缓糖尿病心肌损害。本实验提示银杏总黄酮能够抑制DM大鼠心肌TGF-β1的表达。

1 An D，Rodrigues B.Role of changes in cardiacmetabolism in development of diabetic cardiomyopathy〔J〕.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2006;291(4):H1489-506.

2 季 华，季 强，吴玉珍.银杏叶提取物在眼科及心血管疾病中的治疗应用〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(11):1711-3.

3 方 芳.黄酮类天然药物有效成分治疗糖尿病及其并发症研究进展〔J〕.中山大学研究生学刊(自然科学、医学版)，2007;28(1):39-44.

4 Aneja A，TangWH，Bansilal S，etal.Diabetic cardiomyopathy:insights into pathogenesis，diagnostic challenges，and therapeutic options〔J〕.Am J Med，2008;121(9):748-57.

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7 Khan R，Sheppard R.Fibrosis in heart disease:understanding the role of transforming growth factor-β1 in cardiomyopathy，valvular disease and arrhythmia〔J〕.Immunology，2006;118(1):10-24.

Effect of total ginkgo flavone-glycoides on the expression of transform ing grow th factor-β1 in myocardium of diabetic rats

ZHANG Cui，ZHANG Gen-Bao，ZHU Hai-Long.
Department of Pathophysiology，W annan M edical College，W uhu 241002，Anhui，China

ObjectiveTo explore the effects of total ginkgo flavone-glycoides on the oxidative stress and the expression of transforming growth factor(TGF)-β1 inmyocardium of diabetic rats.MethodsSD ratswere randomly divided:normal control，diabetesmodel and total ginkgo flavone-glycoides groups.Diabetesmodels were induced by STZ through intraperitoneal injection.Blood glucose，the activities of superoxide dismutase(SOD)and the content of malonaldehyde(MDA)in serum and myocardium were analyzed by biochemical methods.ELISA was used to detect the expression of TGF-β1 in myocardial tissue.The morphological changes of myocardium were checked through microscopy.ResultsCompared with diabetesmodel group，level of the blood glucose and the content of MDA were reduced，and the activities of SOD in serum and myocardium were increased in total ginkgo flavone-glycoides.Level of TGF-β1 in myocardium in total ginkgo flavone-glycoides group was dramatically decreased compared with that of diabetesmodel group.ConclusionsTotal ginkgo flavoneglycoides inhibits the expression of TGF-β1 inmyocardium of diabetic rats induced by STZ.Itmay play a protective effect onmyocardium of diabetic rats.

Total ginkgo flavone-glycoides;Diabetic cardiomyopathy;Transforming growth factor-β1;Oxidative stress

R587.2

A

1005-9202(2012)16-3467-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.055

安徽省教育厅自然科学研究重点项目基金(KJ2011A266);皖南医学院中青年科研基金(WK201012)

张根葆(1957-)，男，硕士，教授，主要从事心血管病理生理学方面的研究。

张 翠(1981-)，女，硕士，讲师，主要从事糖尿病及心血管病理生理学方面的研究。

〔2011-06-20收稿 2011-09-18修回〕

(编辑 曹梦园)