Twist基因沉默对人胃癌SGC7901细胞凋亡的影响

刘洪义 邢 金 所 剑 (天津市南开医院，天津 30000)

Twist基因沉默对人胃癌SGC7901细胞凋亡的影响

刘洪义 邢 金1所 剑2(天津市南开医院，天津 300100)

目的 探讨Twist基因沉默对人胃癌SGC7901细胞凋亡的影响。方法 以本课题组稳定转染pGenesil-Twist质粒的人胃癌SGC7901细胞作为研究对象，实验分为三组:对照组、空载体组、Twist基因沉默组。通过倒置显微镜和透射电镜观察Twist基因沉默对SGC7901细胞形态的影响;通过Rhodamine123染色后流式细胞仪检测各组细胞线粒体跨膜电位的变化;采用DAPI染色和TUNEL法观察Twist基因沉默对SGC7901细胞凋亡情况的影响。结果 与对照和空载体组相比，倒置显微镜下观察显示基因沉默组细胞生长缓慢，细胞形态发生明显改变，有较多细胞呈圆形，细胞异型性小;透射电镜观察显示Twist基因沉默组细胞体积变小，微绒毛减少，细胞突触变短且增多，空泡增多，核质比例降低，异染色质团块状分布，核周间隙更大;Rhodamine123染色后流式细胞仪检测结果显示Twist基因沉默组阴性细胞数增高;DAPI染色结果显示细胞核边缘不规则，染色质凝集，着色较重，核固缩，核小体碎片增加;TUNEL法检测显示Twist基因沉默组可见明显细胞核棕黄色染色的阳性细胞。结论 Twist基因沉默促进SGC7901细胞凋亡，提示Twist在胃癌恶性进展中起重要作用，Twist可能成为肿瘤基因治疗的靶点。

胃癌;RNAi;Twist基因;凋亡

研究发现，黑色素瘤、横纹肌肉瘤、前列腺癌、胃癌、甚至胰腺癌等恶性肿瘤中Twist明显高表达〔1～5〕，Twist异常高表达可能引起肿瘤。多数学者认为Twist是癌基因，能调节肿瘤细胞的凋亡、侵袭和转移，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用〔6，7〕。本课题组研究发现〔5〕，Twist在人胃癌SGC7901细胞与胃黏膜上皮GES-1细胞相比表达显著增高，表明Twist可能参与胃癌的发生发展过程。通过对稳定转染pGenesil-Twist质粒的SGC7901细胞的生长活力的研究发现，Twist基因沉默可抑制SGC7901细胞的增殖，本研究将在此基础上进一步探讨抑制细胞增殖的机制，从而明确Twist基因在胃癌发生发展中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌SGC7901细胞由吉林大学中日联谊医院中心实验室惠赠;稳定转染pGenesil-Twist质粒的SGC7901细胞由本实验室建立;RPMI1640培养液购于Invitrogen公司;小牛血清购自杭州四季青公司;In situ cell death detection kit购于德国ROCHE公司;DAPI和Rhodamine123购于美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SGC7901细胞株和稳定转染pGenesil-Twist质粒的SGC7901细胞培养于含10%小牛血清RPMI1640的培养液中，在5%CO2、37℃细胞培养箱中恒温培养。

1.2.2 细胞分组 根据转染的质粒不同，将细胞分为对照组、空载体组、Twist基因沉默组。

1.2.3 倒置显微镜下观察各组细胞形态变化 细胞分组后，将对数生长期细胞接种于24孔板培养至约90%融合时，倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍摄照片。

1.2.4 透射电镜检测细胞超微结构变化 将对数生长期细胞在细胞培养瓶中培养至90%融合，0.25%胰酶消化收集细胞，取106～107个细胞，1 000 r/min，离心5 min，使细胞形成微团，0.1 mol/L PBS洗涤细胞3次，1 000 r/min，离心5 min，使细胞形成致密微团，细胞团先用4%戊二醛固定，再用1%锇酸固定，梯度乙醇脱水，Epon812环氧树脂包埋，LKB-NOVA型超薄切片机切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色，最后HITACHI H-7650型透射电镜观察并拍摄照片。

1.2.5 线粒体跨膜电位检测 将对数生长期细胞接种于6孔板培养至约70%融合时，计数各组细胞，取1×106细胞置于1.5 m l EP管中，PBS洗3次，在500μl体系中加入终浓度为2 μmol/L Rhodamine123于细胞中，37℃，5%CO2孵育30 min，流式细胞仪检测并分析结果。

1.2.6 DAPI染色 将DAPI染液用甲醇稀释10～20倍，制成2μg/ml的DAPI工作液。将培养至90%融合的各组细胞弃去培养液，加入500μl DAPI工作液洗一次，再加入500μl的DAPI工作液37℃染色15 min，离心弃去染色液，甲醇漂洗一次，滴加Buffer A，荧光显微镜下观察，拍摄照片，并统计各组中的阳性细胞，在高倍镜下各组细胞选取20个视野，计数每个视野中细胞核着色强阳性的细胞数。

1.2.7 TUNEL原位细胞凋亡检测 按试剂盒(In situ cell death detection kit，POD)说明配制TUNEL反应液。采用多聚赖氨酸处理盖玻片防止细胞脱片，将高压灭菌后的盖玻片放入孔板中，分组接种细胞，待细胞90%融合时，取出盖玻片进行后续试验，梯度酒精水化后，PBS冲洗2次，每次3 min，蛋白酶 K(20 μg/m l，10 mmol/L Tris/HCl，pH 7.4 ～8.0，21℃ ～37℃消化15～30 min)消化，PBS冲洗2次，每次3 min，每片加50μl的0.3%H2O2甲醇溶液，阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗，每片加25～50μl的TUNEL反应液，37℃孵育盒中孵育60 min，PBS冲洗，每片加25～50μl的辣根过氧化物酶抗体37℃，孵育盒中孵育60 min，PBS冲洗，每片加一滴新鲜配制的DAB室温孵育5～10 min，镜下观察到细胞核呈现棕黄色的阳性细胞时终止反应，PBS冲洗，苏木精复染，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。

1.3 统计学分析 应用SPSS12.0统计软件，采用方差分析法检测各组实验数据差异。

2 结果

2.1 倒置显微镜下观察细胞形态变化 对照和空载体组细胞生长较快，细胞形态不规则，异型性大，培养基中未见明显悬浮的死细胞，而基因沉默组细胞生长缓慢，细胞形态发生明显改变，有较多细胞呈圆形，细胞异型性小，培养基中可见明显悬浮的死细胞，提示Twist基因沉默使SGC7901细胞生长缓慢，形态发生变化。见图1。

2.2 透射电镜下观察细胞的超微结构变化 与对照和空载体组细胞相比，Twist基因沉默后细胞体积变小，微绒毛减少，细胞突触变短且增多，排列紊乱，空泡增多，核质比例降低，髓样小体增多，内质网显著扩张，异染色质团块状分布，核周间隙更大，线粒体髓鞘样变化尤为显著。结果提示Twist基因沉默可能使SGC7901细胞发生凋亡。见图2。

2.3 Twist基因沉默对SGC7901细胞线粒体膜电位的影响与对照组〔(4.4±0.9)%〕和空载体组〔(4.9±1.2)%〕相比，Twist基因沉默组阴性细胞数〔(14.0±0.9)%〕显著增高(P＜0.001)，提示Twist基因沉默可能促使SGC7901细胞凋亡。见图3。

图1 倒置显微镜下观察细胞形态(×400)

图2 透射电镜下观察细胞超微结构

图3 线粒体跨膜电位流式细胞仪分析图

2.4 DAPI染色检测Twist基因沉默对SGC7901细胞的影响对照和空载体组细胞核呈圆形，边缘清晰，染色均匀，而基因沉默组细胞核边缘不规则，染色质凝集，着色较重，并且有核固缩现象。见图4。Twist基因沉默组细胞核着色强阳性细胞数明显高于对照和空载体组(P＜0.001)。提示Twist基因沉默促进SGC7901细胞凋亡。

图4 细胞凋亡DAPI染色(×400)

2.5 TUNEL法检测Twist基因沉默对SGC7901细胞的影响Twist基因沉默组细胞可见有明显细胞核呈棕黄色染色的阳性细胞，此细胞即凋亡细胞，而对照和空载体组较少见阳性细胞。见图5。对照组和空载体组阳性细胞数分别为14.5±3.8和15.2±2.1，Twist基因沉默组阳性细胞数为35.1±8.2，与对照和空载体组相比，Twist基因沉默组阳性细胞数增高(P＜0.001)。提示Twist基因沉默促进SGC7901细胞凋亡。

图5 TUNEL法检测各组细胞凋亡情况

3 讨论

近年来的研究发现Twist和肿瘤的发生有关，有报道认为Twist基因是一个原癌基因，能通过不同的途径抑制细胞的凋亡〔4，8〕，与肿瘤侵袭、转移和增殖相关。Twist在黑色素瘤、前列腺癌、肝癌、胰腺癌等恶性肿瘤中表达明显上调〔2，4，6，7〕。本课题组前期的研究发现Twist基因在胃癌SGC7901细胞高表达，且与细胞的增殖能力相关〔5〕，这与文献报道相一致，本研究将在此基础上进一步探讨Twist抑制细胞增殖的机制，从而明确Twist基因在胃癌发生发展中所发挥的作用。研究发现Twist基因沉默SGC7901细胞后细胞生长缓慢，细胞形态发生明显改变，有较多细胞呈圆形，细胞异型性小，透射电镜观察进一步显示Twist基因沉默后细胞体积变小，微绒毛减少，细胞突触变短且增多，空泡增多，核质比例降低，异染色质团块状分布，核周间隙更大。结果提示Twist基因沉默后SGC7901细胞出现凋亡，使增殖抑制。为了进一步证实Twist基因沉默后细胞是否发生凋亡，首先检测细胞线粒体跨膜电位的改变，因为它是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，在细胞核凋亡特征出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。结果显示Twist基因沉默组Rhodamine123阴性细胞数显著增高，提示Twist基因沉默能够降低细胞线粒体膜电位，细胞可能发生凋亡，进一步通过DAPI染色和TUNEL法检测细胞的凋亡情况，结果提示Twist基因沉默后细胞发生凋亡。本研究结合文献报道，证实Twist基因沉默促进细胞凋亡，揭示了Twist基因与胃癌的发生发展相关，Twist可能成为胃癌基因治疗的靶点，但是Twist基因沉默促进细胞凋亡的确切机制还未明确，有待进一步探讨。

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4 Ohuchida K，Mizumoto K，Ohhashi S，etal.Twist，a novel oncogene，is upregulated in pancreatic cancer:clinical implication of Twist expression in pancreatic juice〔J〕.Int JCancer，2007;120(8):1634-40.

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R73

A

1005-9202(2012)16-3464-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.054

1 吉林省前卫医院普外科 2 吉林大学第一医院胃结直肠外科

所 剑(1957-)，男，主任医师，教授，博士生导师，主要从事消化道肿瘤研究。

刘洪义(1972-)，男，主治医师，主要从事消化道肿瘤研究。

〔2012-01-15收稿 2012-03-20修回〕

(编辑 徐 杰)