假酸浆水提液对2型糖尿病模型大鼠肝糖原合成关键酶表达的影响

卞德强 孟庆媛 庞玉军 窦建华 王 昭 (佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 54007)

假酸浆水提液对2型糖尿病模型大鼠肝糖原合成关键酶表达的影响

卞德强 孟庆媛1庞玉军 窦建华 王 昭1(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154007)

目的 研究假酸浆(NPG)水提液对2型糖尿病(T2DM)模型大鼠肝糖原合成关键酶表达的影响。方法 用50只Wistar大鼠作为受试对象制作糖尿病模型。一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制备2型糖尿病大鼠模型。以NPG水提液进行灌胃，测定血糖及肝脏糖原合成酶、葡萄糖-6-磷酸酶的表达水平。结果 NPG能有效地降低血糖。NPG水提液低剂量组(2.5 ml/kg)能增加大鼠肝脏组织糖原合成酶mRNA的表达(P＜0.05)，降低大鼠肝脏葡萄糖-6-磷酸酶mRNA的表达(P＜0.01)。结论 NPG是一种有效的降血糖药，可以加强糖原合成，进而降低血糖。

假酸浆;糖原合成酶;葡萄糖-6-磷酸酶

假酸浆(NPG)为当年生茄科植物，其全草可以入药，其花朵在民间常用于治疗2型糖尿病(T2DM)，并有显著的降糖效果〔1，2〕。本文主要研究NPG对T2DM模型大鼠的降糖作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 纯系Wistar大鼠50只，雌雄各半，2～3月龄，体重200～250 g，由佳木斯大学动物实验中心提供。

1.1.2 实验中药 中药NPG由本课题组培养种植，经鉴定符合药典标准。白糖、猪油、蛋黄粉由超市购得，均符合国家食品检验检疫标准。

1.1.3 主要试剂 NPG水提液(佳木斯大学生物化学实验室提制);二甲双胍(湖北远成药业有限公司);琼脂糖(华舜生物工程有限公司);焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水(上海生工生物工程有限公司);Trizol、RT-PCR试剂盒(大连宝生物有限公司);链脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，引物由北京奥科生物有限公司合成。

1.1.4 实验仪器 超净工作台(哈尔滨蓝皓空气净化设备有限公司);DU800核酸蛋白分析仪(德国Beckman公司);TGL-20M高速台式冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);PCR仪(Whatman Biometra公司);YLN-2000凝胶成像分析系统(北京亚力恩机电技术研究所);强生血糖仪〔强生LIFESCAN，强生(上海)医疗器材有限公司〕。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的制备及分组给药 随机留取10只大鼠作为正常组(NOR)，给予基础饲料，其余50只大鼠给予高糖高脂饲料。持续喂养4 w后，一次性腹腔注射STZ溶液50 mg/kg，而正常组注射相同体积的枸橼酸钠-枸橼酸缓冲液，72 h后测空腹血糖，以血糖值高于11.1 mmol/L为造模成功。NPG的花提纯后的生药浓度为0.2 g/ml。成模大鼠继续喂以高糖高脂饲料，并随机分为糖尿病模型组(MOD)、NPG高(JHG)、中(JHZ)、低(JHD)剂量治疗组(10，5，2.5 m l·kg－1·d－1)，每组10只，连续灌胃8 w。模型组及正常组同时灌服生理盐水。

1.2.2 标本采集 末次给药后6 h，断头处死，取血清备用，取肝脏及骨骼肌置于液氮中速冻，迅速转移置－80℃冰箱保存。

1.2.3 血糖、血脂检测 采用强生血糖仪及全自动生化分析仪进行检测。

1.2.4 总RNA抽提及鉴定 常温解冻，切取约50 mg肝组织、小肠组织或50 mg骨骼肌组织分别置匀浆管中，匀浆管冰浴。往匀浆管中加入1 ml预冷的 Trizol液，匀浆，室温放置5 min，4℃ 12 000 r/min离心5 min。转移上清至一新Eppendorf(EP)管中，加入0.2 ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15 s，室温放置5 min，4℃ 12 000 r/min离心15 min。转移上层水相至另一新EP管中(约300～400μl)，加入0.5 ml异丙醇，充分混匀后室温放置20 min，12 000 r/min离心10 min。弃上清，沉淀加入1 ml预冷的75%乙醇(DEPC水配制)振荡洗涤RNA，沉淀一次，12 000 r/min离心5 min。小心弃去上清，沉淀置超净工作台开风机吹干，加 40μl DEPC水溶解。测定所提取总RNA的OD260/OD280，检验所提取的总RNA的纯度，以OD260/OD280在1.8～2.0之间为纯度较好，可以用于cDNA的合成。按RT-PCR试剂盒合成cDNA进行PCR反应。

1.2.5 PCR反应 以合成的cDNA为模板进行扩增反应。用β-actin作为内参。其引物分别为上游:TGCCCATCTATGAGGGTTAC;下游:CTGGAAGGTGGACAGTGAG，扩增片段长度为572 bp，退火温度为59℃。糖原合成酶(GSY)引物分别为上游:CCATTCCCTGCCTGTTCCA;下游:ATCGGCTACCTTTGCTTTC，退火温度为60℃，扩增片段长度为698 bp。葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)引物分别为上游:CACCTTGACACTACACCCTT;下游:AATCCACCAAACACTCCC，退火温度为59℃，扩增片段长度为697 bp。

1.2.6 PCR扩增产物电泳 PCR产物与上样缓冲液按4∶1混合，每孔道加8μl混合液，上样后于电泳槽中电泳，电压为80 V，时间为40 min，EB中染色15 min，结果用凝胶成像系统扫描，用目的基因区带的灰度值与内参β-actin区带的灰度值之比确定各目的基因的表达水平。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行分析，实验结果以±s表示，进行方差分析，组间差异性检验用q检验。

2 结果

2．1各组大鼠血糖、血脂水平变化 STZ注射72 h后大鼠血糖、血脂变化见表1。用药8 w末大鼠血糖变化见表2。

2．2各组大鼠GSY mRNA水平比较 糖尿病模型组大鼠GSY mRNA表达水平(0.481±0.159)比正常组(0.967±0.272)明显减少，NPG低剂量组大鼠肝脏GSY mRNA表达水平(0.910±0.248)较模型组上调，差异有极显著性意义(P＜0.01)。NPG中、高剂量组GSYmRNA表达水平分别为0.543±0.195、0.669±0.222。提示NPG低剂量可提高糖尿病大鼠肝脏GSY mRNA的表达。见图1。

2．3各组大鼠G6PmRNA表达水平比较 糖尿病模型组大鼠G6PmRNA表达水平(0.901±0.253)比正常组(0.570±0.183)明显增多，NPG低剂量组大鼠肝脏G6PmRNA表达水平(0.556±0.175)较模型组下调，差异有极显著性意义。提示NPG低剂量可降低糖尿病大鼠肝脏G6PmRNA的表达。NPG中、高剂量组 G6P mRNA表达水平分别为 0.670±0.182、0.752±0.225。见图2。

表1 各组大鼠血脂、血糖变化(±s，mmol/L)

表1 各组大鼠血脂、血糖变化(±s，mmol/L)

与正常组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

组别 n 血糖 血脂正常组10 5.0±0.65 0.32±0.18造模组 40 21.6±4.91) 0.55±0.212)

表2 各组大鼠用药前后空腹血糖变化(±s，n=10，mmol/L)

表2 各组大鼠用药前后空腹血糖变化(±s，n=10，mmol/L)

组别 给药前血糖 给药第8周末血糖正常组 5.0±0.62) 5.0±1.42)模型组 22.6±4.9 30.6±7.9 NPG低剂量组 23.2±4.0 12.7±4.12)NPG中剂量组 21.5±3.4 18.4±3.72)NPG高剂量组 21.7±4.6 22.3±1.41)

图1 各组GSY m RNA表达水平

图2 各组G6Pm RNA表达水平

3 讨论

糖尿病的主要表现为病理性高血糖。因此，糖尿病的治疗中最关键的环节还是降血糖。高血糖发生的本质是血糖的生成与消耗之间失去了正常的动态平衡。糖原合成减少，分解加速，在酶的作用下，大量G6P转化为葡萄糖;糖原异生作用加强，即由非糖物质转化为葡萄糖的速度加快，葡萄糖生成增多，葡萄糖转化为G6P的作用减弱，葡萄糖的利用减慢;糖酵解和三梭酸循环减弱;在肌肉及脂肪组织中，葡萄糖进入细胞膜的速度减慢。所有这些作用的结果将导致葡萄糖的生成增多，消耗减少，从而造成高血糖。而GSY是肝脏和肌肉糖原合成的限速酶，是胰岛素作用的主要靶酶，其去磷酸化后即被激活，磷酸化时即失去活性〔3〕。胰岛素能够抑制内源性葡萄糖的产生和刺激外周组织摄取葡萄糖，增加肝脏合成糖原的能力，通过激活GSY磷酸酶，使GSY去磷酸化，从而提高GSY的活性，促进糖原合成。糖原合成受损，就会出现血糖升高。

G6P是催化G6P水解为葡萄糖的关键酶，该反应是糖原分解和糖异生的最后一步反应〔4〕。肝脏G6P的合成与水解失平衡是导致糖尿病肝糖输出调节功能异常的主要原因。通过实验发现，NPG水提液可明显减低糖尿病模型大鼠血糖，NPG水提液低剂量组能增加大鼠肝脏组织糖原合成酶mRNA的表达，降低大鼠肝脏G6PmRNA的表达，从而抑制糖异生，促进糖原合成，降低血糖。

本实验表明，NPG可以降低T2DM模型大鼠血糖，上调大鼠肝脏GSY mRNA的表达，下调大鼠肝脏G6PmRNA的表达，从而降低T2DM模型大鼠的血糖。

1 Oda K.Examination of the treatmentof eldly type2 diabetes is it possible to change from insulin to oral hypoglycemic agents〔J〕.Gan To Kagaku Ryoho，2000;27(3):711-3.

2 周卫芬，王秋娟，韩 莹，等.香豆素磺酰脲类化合物的降血糖作用研究〔J〕.中国药科大学学报，2003;34(2):160-2.

3 Grimes CA，Jope RS.Themultifaceted roles of glycogen synthase kinase 3beta in cellular signaling〔J〕.Prog Neurobiol，2001;65(4):391-426.

4 刘德敏，方显峰，孙 颖，等.氯化锂对大鼠肝细胞葡萄糖-6-磷酸酶基因表达的影响〔J〕.天津医科大学学报，2006;12(1):14-6.

R587.1

A

1005-9202(2012)16-3492-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.068

1 佳木斯大学基础医学院

王 昭(1972-)，男，副教授，博士，主要从事肿瘤与糖尿病药物的研究。

卞德强(1978-)，男，医师，硕士，主要从事糖尿病的治疗与药品开发研究。

〔2012-02-15收稿 2012-03-04修回〕

(编辑 袁左鸣)