2%氢气生理盐水对阿尔茨海默病大鼠海马神经细胞的保护作用

周风华 吕世军 (潍坊医学院病理学教研室，山东 潍坊 261053)

2%氢气生理盐水对阿尔茨海默病大鼠海马神经细胞的保护作用

周风华 吕世军 (潍坊医学院病理学教研室，山东 潍坊 261053)

目的 探讨2%氢气生理盐水治疗的阿尔茨海默病(AD)大鼠学习、记忆能力以及海马神经元及神经胶质细胞的形态学变化的影响。方法 雄性SD大鼠，随机分为正常对照组、生理盐水治疗组及2%氢气生理盐水治疗组，每组各10只。按6 mg/kg腹腔注射三甲基锡(TMT)诱导AD大鼠模型。按10 m l/kg腹腔注射2%氢气生理盐水进行治疗，生理盐水治疗组按同样剂量进行注射。Morris水迷宫实验检测大鼠空间学习、记忆能力，尼氏染色观察大鼠海马神经元数量及尼氏小体的变化，免疫组织化学检测caspase-3在海马神经元的表达，电镜观察海马神经元及胶质细胞超微结构的变化。结果 2%氢气生理盐水能显著改善AD大鼠空间学习、记忆能力障碍，抑制caspase-3的表达活性，降低海马神经元的凋亡，保护神经元，同时电镜检测显示海马神经元及胶质细胞的超微结构得到改善。结论 2%氢气生理盐水能够改善海马神经元及胶质细胞的超微结构，抑制细胞凋亡，保护神经组织，从而提示2%氢气生理盐水对AD有保护治疗作用，其深层机制有待进一步探讨。

阿尔茨海默病;三甲基锡;2%氢气生理盐水;caspase-3

阿尔茨海默病(AD)的发病有多种学说，其中胶质细胞的活化、炎症反应及自由基的产生引起的神经元损伤是发病机制的重要环节。三甲基锡(TMT)是一种强效的神经毒剂，可引起边缘系统尤其是海马区神经元的损伤，从而导致学习及记忆功能的损害〔1〕，可作为研究AD的动物模型〔2〕。氢是自然界最简单的元素，氢气是无色、无嗅、无味、具有一定还原性的双原子气体。氢气在生物体内具有抗氧化作用，目前已证实氢气可治疗多种疾病。本实验探讨2%氢气生理盐水对AD大鼠的治疗保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物 成年 SD大鼠，30只，8周龄，雄性，180～200 g，SPF级，由山东省中医药大学提供，每笼5只，23℃ ～25℃，55%湿度，每天采光12 h，常规饮食饮水。

1.2 药物及实验试剂 TMT由广东省职业病防治院唐小江教授惠赠，购自美国Acros organics，批号:12335301，常温无菌生理盐水溶解，4℃保存;2%氢气生理盐水由上海第二军医大学孙学军教授惠赠，4℃密闭保存;甲苯胺蓝购自美国Sigma公司;兔抗人多克隆抗体caspase-3，工作液，购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.3 大鼠模型构建、分组及给药 随机选取20只大鼠，腹腔注射TMT无菌生理盐水溶液(6 mg/kg)一次，诱导AD模型，另外10只作为正常对照组。20只大鼠随机分为生理盐水治疗组、2%氢气生理盐水治疗组，每组各10只，于TMT注射后2 h，按8 m l/kg的量分别腹腔注射生理盐水及2%氢气生理盐水，连续2 w，前7 d上午、下午各一次，后7 d每天一次。

1.4 水迷宫实验 对各组实验大鼠，实验期间进行水迷宫实验，每天1次，共测7次，录像，并对录像进行分析，得出运动的平均潜伏期及运动轨迹，分别测量四个不同入水点的潜伏期。

1.5 标本采集 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛溶液灌注。迅速断头处死，取脑，10%中性甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，60℃温箱浸蜡过夜，包埋框包埋，自然冷却凝固。将石蜡包埋组织连续切片，厚5μm，待用。另分离部分海马，将新鲜组织制成1 mm小块，迅速浸入预冷的3%戊二醛中前固定，待做电镜标本。

1.6 尼氏染色 切片脱蜡至水，1%的甲苯胺蓝染液，60℃，2～3 min，蒸馏水冲洗，梯度酒精分化，无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察海马CA3及CA4区神经元数量变化(放大400倍)，随机选取10个高倍视野，进行细胞计数，取其平均值，并在显微图像分析系统中检测神经元内尼氏小体的灰度变化，取其平均值。

1.7 免疫组织化学 切片脱蜡至水，3%H2O2去离子水孵育，PBS浸泡，微波抗原修复，自然冷却至室温，滴加封闭用正常山羊血清工作液37℃孵育，倾去，勿洗，滴加一抗caspase-3，以PBS代替一抗作为阴性对照，4℃过夜，室温放置30 min，PBS冲洗，，滴加生物素标记山羊抗鼠IgG工作液，37℃孵育，PBS冲洗，滴加SP工作液，37℃孵育，PBS冲洗，DAB显色，镜下控制显色时间，自来水终止反应，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察神经元的表达情况，拍照，图像分析系统采集灰度值并分析。

1.8 电镜 电镜标本经醋酸双氧铀，枸橼酸铅染色。由潍坊医学院形态学实验中心电镜室观察。

2 结果

2.1 学习记忆能力 各组平均潜伏期分别为:正常对照组:(5.2 ±0.3)s，(5.3 ±0.6)s，(8.5 ±0.1)s，(6.4 ±0.2)s。生理盐水治疗组:TMT注射后的第3天，大鼠出现明显的学习记忆能力的损伤，极少数大鼠能够在1 min内找到平台，潜伏期明显延长，且不稳定，大多数大鼠在1 min内未能找到平台。2%氢气生理盐水治疗组:大鼠能找到平台，但是潜伏期较正常对照组延长，分别为(19.6±0.5)s，(20.3±0.2)s，(28.5±0.6)s，(21.4 ±0.3)s。

2.2 尼氏染色 正常对照组，海马神经元数量较多，尼氏小体丰富;生理盐水治疗组，海马区尤其是CA3及CA4区部分神经元水肿部分神经元胞体内尼氏小体消失，细胞核固缩及溶解，较正常对照组神经元数量减少(P＜0.05);氢气生理盐水治疗组较正常对照组神经元数量减少，但无显著差异(P＞0.05)，较生理盐水组神经元数量明显增多(P＜0.05)。见表1，图1。

2.3 免疫组织化学染色 免疫组织化学染色阳性表达部位在细胞核，呈棕黄色颗粒状。正常对照组少数海马神经元表达，灰度值为0.32±0.01;生理盐水治疗组，caspase-3阳性细胞数量增多，灰度值为0.76±0.05，与正常对照组差异显著(P＜0.05);氢气生理盐水治疗组，阳性细胞较生理盐水治疗组减少，灰度值为0.68±0.03，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 1，图 2。

表1 海马CA3、CA4区神经元计数比较及caspase-3灰度值比较(±s)

表1 海马CA3、CA4区神经元计数比较及caspase-3灰度值比较(±s)

与正常对照组比较:1)P＜0.05

组别 神经元计数23.6±0.71 0.32±0.01生理盐水组 15.3±0.151) 0.76±0.051)氢气生理盐水治疗组 21.4±0.51) 0.68±0.031)caspase-3正常对照组

图1 各组尼氏小体(尼氏染色，×400)

图2 各组大鼠海马神经元caspase-3免疫组化表达(SP，×400)

2.4 电镜观察 生理盐水治疗组海马神经元，表现为粗面内质网及游离核糖体数量减少，部分区域出现似板层状颗粒结构，小胶质细胞及星形胶质细胞胞质电子密度降低，胶质细胞可见核周隙局部增宽;氢气生理盐水治疗组，海马神经元胞质内粗面内质网及游离核糖体较丰富，胶质细胞未见明显异常。

3 讨论

胶质细胞的活化、炎症发生以及自由基的产生在AD发病中发挥了重要作用。小胶质细胞和星形胶质细胞的活化，可导致神经元损伤〔3〕。

氢气在生物体内具有抗氧化作用，目前已证实氢气可治疗多种疾病。高压氢气可有效治疗动物皮肤恶性肿瘤，并认为是通过抗氧化作用〔4〕。2001年，法国潜水医学家证明，呼吸8个大气压高压氢气可治疗肝曼森血吸虫感染引起的炎症反应，首次证明氢气具有抗炎作用，并提出氢气与羟自由基直接反应是治疗炎症损伤的基础〔5〕。有人报道，动物呼吸2%的氢气就可有效清除自由基，显著改善脑缺血再灌注损伤，他们采用化学反应、细胞学等手段证明，氢气溶解在液体中可选择性中和羟自由基和亚硝酸阴离子〔6〕。早期治疗可明显改善新生儿脑缺血缺氧损伤晚期神经功能和学习记忆能力。上述研究表明，作为一种选择性抗氧化物质，氢气对某些疾病具有治疗作用。

海马CA3到CA1区椎体细胞的突触连接对于空间学习及记忆能力的形成是非常重要的〔7〕。TMT是一种强效的神经毒性有机锡化合物，可显著诱导大鼠海马CA3区神经元的变性及坏死，从而导致空间学习及记忆功能的损害，诱导AD模型。大量研究表明，TMT诱导的神经元损伤与活性氧自由基及活性氮自由基的产生有关。TMT可引起脑组织中小胶质细胞及星形胶质细胞的增生，释放大量的细胞因子(如IL-1、TNF-α等)诱发炎症反应，同时体内产生大量的自由基〔8～10〕，自由基的产生损伤神经元，造成神经元的变性及坏死。

本实验发现，TMT注射后的大鼠，其空间学习记忆能力明显受损，caspase-3表达活性增强，海马CA3及CA4区神经元出现核固缩现象，尼氏小体减少，海马神经元及胶质细胞均出现了超微结构的改变。而经2%的氢气生理盐水同时治疗后，学习记忆能力明显改善，海马神经元的数量明显增加，尼氏小体数量增加，caspase-3的活性降低，抑制了海马神经元的凋亡，并且胶质细胞的超微结构改善，能够很好地治疗TMT引起的AD，而氢气对该模型神经元的保护作用是否与抗氧化有关目前尚未证实，这将是我们下一步工作的重点。

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5 Gharib B，Hanna S，AbdallahiOM.Anti-inflammatory propertiesofmolecular hydrogen:investigation on parasite-induced liver inflammation〔J〕.C R Acad SciⅢ，2001;324(8):719-24.

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R361

A

1005-9202(2012)16-3484-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.064

山东省教育厅课题(J12LK51)

吕世军(1961-)，男，教授，博士，硕士生导师，主要从事神经病理学研究。

周风华(1977-)，女，讲师，硕士，主要从事神经病理研究。

〔2011-03-14收稿 2011-07-10修回〕

(编辑 曹梦园)