番石榴叶总三萜对2型糖尿病大鼠的降血糖和血脂作用*

王婧茹， 赵晶晶， 叶春玲△， 叶开和， 张晓琦， 王 英， 叶文才

(1暨南大学药学院药理学教研室，3暨南大学药学院中药及天然药物研究所，暨南大学中药药效物质基础及创新药物研究广东省高校重点实验室，广东广州510632;2广东省妇幼保健院药学部，广东广州510010)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种严重危害人类健康的内分泌代谢疾病，其并发症已成为继心脑血管疾病和肿瘤之后人类第三大致死原因［1］。番石榴(Psidium guajava L.)为桃金娘科番石榴属植物，广泛分布于我国岭南地区。上世纪80年代，我国在进行植物药普查中发现，民间用番石榴叶来防治糖尿病;以番石榴叶粗提取物为原料的制剂“消渴降糖胶囊”的临床疗效显著，但其降血糖的活性成分和作用机制尚不清［2］。本课题组在前期研究中发现番石榴叶总三萜(total triterpenoids from Psidium guajava leaves，TTPGL)能显著降低1型糖尿病小鼠的血糖水平，因而推测TTPGL可能是番石榴叶降血糖的有效部位。为进一步研究TTPGL的抗糖尿病作用，本实验建立了2型糖尿病(type 2 DM，T2DM)动物模型，观察其对糖尿病大鼠血糖和血脂的影响并探讨其作用机理。

材料和方法

1 材料

1.1 动物与饲料 4周龄清洁级健康SD大鼠90只，雄性，体重150～180 g，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(粤)2008－0002。高脂饲料:猪油18%，蔗糖20%，蛋黄3%，基础饲料59%，由广东省医学实验动物中心提供。

1.2 试剂与药品 番石榴叶总三萜通过溶剂法纯化工艺提取，收率为3.3%。链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，购自Sigma;盐酸罗格列酮片，购自上海三维制药有限公司;胰岛素放免试剂盒，购自北京普尔伟业生物科技有限公司。葡萄糖测试盒、游离脂肪酸测试盒、糖化血红蛋白测试盒、糖化血清蛋白测试盒，均购自南京建成生物工程研究所。甘油三酯测定试剂盒、总胆固醇测定试剂盒，购自温州东瓯津玛生物科技有限公司。兔抗过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator－ activated receptor γ，PPARγ)(H －100)(sc－7196，Santa Cruz);辣根过氧化物酶标记羊抗兔Ⅱ抗和兔抗大鼠β－actin单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;SDSPAGE凝胶配制试剂盒和ECL显影试剂盒购自碧云天生物科技研究所。

1.3 仪器 OneTouch强生稳步血糖仪购自强生(中国)医疗器材有限公司，配套试纸批号为2990326011;Model 680酶标仪购自Bio－Rad;低温离心机购自Sigma;LAC－110.4型电子分析天平购自赛多利斯公司;SN－682B全自动γ计数器购自上海日环仪器有限公司;WO－9413B型凝胶成像系统购自北京六一仪器厂;POWER BC数控电泳仪购自上海申能博彩生物科技有限公司。

2 方法

2.1 2型糖尿病动物模型的建立及分组 雄性SD大鼠90只，分为正常对照组动物(control)12只和糖尿病建模动物78只，正常组动物给予基础饲料，建模动物给予高脂饲料。喂养4周后，禁食12 h，建模组腹腔注射2%STZ溶液(35 mg·kg－1)，1周后测定大鼠葡萄糖负荷2 h血糖(禁食12 h，给予2 g·kg－1的葡萄糖灌胃，测2 h后的血糖)，筛选血糖值大于11.1 mmol·L－1的大鼠确定为糖尿病大鼠。

模型稳定1周后，将成模的糖尿病大鼠60只随机分为5组，即番石榴叶总三萜高剂量组(TTPGLH，240 mg·kg－1)、中剂量组(TTPGL － M，120 mg·kg－1)、低剂量组(TTPGL － L，60 mg·kg－1)，罗格列酮组(rosiglitazone，RSG，3 mg·kg－1)，糖尿病模型组(model)，每组各12只。

2.2 给药方法 给药组每天给予不同剂量的番石榴叶总三萜或罗格列酮灌胃，模型组和正常对照组则给予同体积的生理盐水灌胃。每天给药1次，连续给药6周。每周末称量体重，根据体重调整给药剂量。

2.3 观测指标及方法 采用强生公司OneTouch稳步型血糖仪监测实验期间大鼠静脉全血血糖值。给药6周结束后取大鼠血清，采用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(fasting blood glucose，FBG);放射免疫测定法测定大鼠空腹血清胰岛素含量(fasting insulin，FINS)，并计算胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index，ISI=ln［FBG × FINS－1］);果糖胺法测定大鼠糖化血清蛋白(glycosylated serunm proteins，GSP)含量;酶联免疫法测定大鼠血清甘油三酯(triglyceride，TG)和总胆固醇(total cholesterol，TCH)含量;酶联免疫吸附法测定大鼠血清游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)含量。取红细胞制备溶血液，测定糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin，GHb)含量。取大鼠肾周部位脂肪组织，生理盐水冲洗后置－70℃冰箱保存，备测PPARγ蛋白的表达。

2.4 Western blotting检测脂肪组织PPARγ蛋白表达 将脂肪组织于冰浴中匀浆后，经4℃、12 000 r·min－1高速离心30 min提取蛋白。应用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。将提取的组织蛋白变性处理后，每孔50 μg蛋白上样，其中1个上样孔加入10 μL预染蛋白 marker，进行电泳(5%浓缩胶90 V，10%分离胶110 V，不恒定电流)，约1.5 h，完毕后取分离胶转印到硝酸纤维膜，5%脱脂奶粉室温封闭30 min ，4 ℃过夜，加入兔抗 PPARγ(1∶200)，37 ℃反应1 h或4℃过夜，用PBS洗膜，第1次15 min，后3次每次5 min。加5 mL羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)，37℃反应1 h，洗膜同上。用ECL显色试剂显示目的条带，采用WO－9413B型凝胶成像系统自带软件Gelpro32来分析胶片中的蛋白条带。

3 统计学处理

结 果

1 一般状态

整个实验期间，正常组大鼠饮食、饮水及活动等行为正常。高糖高脂饮食+腹腔注射小剂量STZ后约10 d，糖尿病大鼠逐渐出现多饮、多尿、多食、消瘦等症状，并出现毛色暗哑，精神萎靡，反应迟钝，动作迟缓的状况。实验期间，模型组糖尿病大鼠以上状态并未改善;而各给药组糖尿病大鼠上述症状则明显缓解，一般状况有所改善。

实验期间正常组大鼠体重逐渐增加，而糖尿病大鼠体重明显降低，显著低于正常组(P＜0.01)，尤以第2周体重下降明显;但从第3周开始，糖尿病大鼠体重逐渐增加。第6周时，罗格列酮组、番石榴叶总三萜低剂量组大鼠体重有所增加，但与模型组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，见图1。

Figure 1.Changes of the weight of rats during the experiment.±s.n=9.＊＊ P ＜0.01 vs model.图1 实验期间大鼠每周体重变化

2 糖尿病模型组动物实验期间血糖变化

模型成功后，在给药的6周内，每周监测糖尿病模型组与正常组大鼠的空腹血糖。结果发现，在整个实验期间，正常组动物空腹血糖稳定在正常水平，低于7.0 mmol·L－1;模型组糖尿病大鼠血糖显著高于正常组(P＜0.01)，且一直维持在高于15.0 mmol·L－1的高血糖状态，见图2。

Figure 2.Changes of FBG in rats during the experiment.±s.n=9.＊＊P ＜0.01 vs control.图2 实验期间大鼠每周FBG变化

3 番石榴叶总三萜对糖尿病大鼠FBG、FINS和ISI变化的影响

与正常对照组相比，模型组的FBG显著升高，FINS和ISI明显降低，2组间有显著差异(P＜0.05或P＜0.01)。与模型组相比，番石榴叶总三萜中剂量、高剂量组及罗格列酮组可显著降低糖尿病大鼠的 FBG，升高 FINS和 ISI(P ＜0.05或 P ＜0.01)，见表1。

表1 番石榴叶总三萜对糖尿病大鼠FBG、FINS和ISI变化的影响Table 1.Effects of TTPGL on FBG，FINS and ISI in T2DM rats(±s.n=9)

表1 番石榴叶总三萜对糖尿病大鼠FBG、FINS和ISI变化的影响Table 1.Effects of TTPGL on FBG，FINS and ISI in T2DM rats(±s.n=9)

*P ＜0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜ 0.01 vs model.

Control － 6.65±0.74 16.61±6.00 －4.63±0.27 Model － 17.20±6.02＊＊ 9.98±1.72* －5.24±0.20＊＊TTPGL 60 12.92±5.30＊＊ 14.39±5.17 －4.94±0.43 120 11.20±3.43＊＊##15.97±3.18## －4.90±0.24#240 9.59±2.46＊＊##18.02±4.09## －4.87±0.25#RSG 3 9.22±4.10*##15.05±6.56# －4.66±0.44#

4 番石榴叶总三萜对糖尿病大鼠GHb和GSP变化的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠GHb和GSP显著升高(P＜0.05)。与模型组相比，番石榴叶总三萜给药组糖尿病大鼠血清GSP明显降低(P＜0.01)，但GHb含量仅有轻度下降，差异无统计学意义(P＞0.05);罗格列酮组 GHb和 GSP含量均显著降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)，见表2。

表2 番石榴叶总三萜对糖尿病大鼠GHb和GSP变化的影响Table 2.Effects of TTPGL on GHb and GSP in T2DM rats(±s.n=9)

表2 番石榴叶总三萜对糖尿病大鼠GHb和GSP变化的影响Table 2.Effects of TTPGL on GHb and GSP in T2DM rats(±s.n=9)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model.

Group Dosage(mg·kg－1)GHb(Absorbance·10 g－1)GSP(mmol·L －1)Control － 15.24 ±3.82 1.12 ±0.12 Model － 20.79 ±4.48＊＊ 1.80 ±0.11＊＊TTPGL 60 19.55 ±2.38＊＊ 1.50 ±0.07＊＊##120 19.76 ±3.04＊＊ 1.42 ±0.05*##240 18.16 ±3.89* 1.37 ±0.07*##RSG 3 15.30 ±3.25# 1.32 ±0.06##

5 番石榴叶总三萜对糖尿病大鼠TG、TCH和FFA变化的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠血清TG、TCH及FFA均显著升高(P＜0.01)。与模型组相比，番石榴叶总三萜给药组、罗格列酮组血清TG、TCH及FFA 均显著降低(P ＜0.05或 P ＜0.01)，见表3。

6 番石榴叶总三萜对糖尿病大鼠脂肪组织PPARγ蛋白表达的影响

与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠PPARγ蛋白表达显著下降(P＜0.01)。给药后，番石榴叶总三萜或罗格列酮可显著升高糖尿病大鼠脂肪组织的PPARγ蛋白表达，与模型组相比，差异有统计学意义(P ＜0.05)，见图3、表4。

表3 番石榴叶总三萜对糖尿病大鼠TG、TCH和FFA变化的影响Table 3.Effects of TTPGL on TG，TCH and FFA in T2DM rats(±s.n=9)

表3 番石榴叶总三萜对糖尿病大鼠TG、TCH和FFA变化的影响Table 3.Effects of TTPGL on TG，TCH and FFA in T2DM rats(±s.n=9)

*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model.

Control － 1.00±0.20 1.03±0.16 183.1±36.6 Model － 2.22±0.74＊＊ 1.46±0.11＊＊ 360.3±49.0＊＊TTPGL 60 1.23±0.33*##1.27±0.15*# 197.8±30.8##120 1.11±0.19## 1.22±0.24*# 189.6±26.6##240 1.10±0.29## 1.21±0.19*# 189.6±31.5##RSG 3 1.19±0.49*##1.22±0.17*# 197.8±67.5##

Figure 3.Effects of TTPGL on PPARγ expression in adipose tissues of T2DM rats.图3 番石榴叶总三萜对糖尿病大鼠脂肪组织PPARγ蛋白表达的影响

表4 番石榴叶总三萜对糖尿病大鼠脂肪组织PPARγ蛋白表达的影响Table 4.Effects of TTPGL on PPARγ expression in adipose tissues of T2DM rats(±s.n=3)

表4 番石榴叶总三萜对糖尿病大鼠脂肪组织PPARγ蛋白表达的影响Table 4.Effects of TTPGL on PPARγ expression in adipose tissues of T2DM rats(±s.n=3)

*P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs model.

Group Dosage(mg·kg－1) PPARγ/β －actin Control － 0.2954 ±0.0890 Model － 0.1723 ±0.0420*TTPGL 60 0.2011 ±0.0500*120 0.2432 ±0.0610#240 0.2302 ±0.0570#RSG 3 0.2557 ±0.0630#

讨 论

采用高糖高脂饲料加小剂量STZ方法建立2型糖尿病模型是目前最常采用的方法［3－4］。本实验发现，高糖高脂喂养4周，腹腔注射小剂量STZ(35 mg·kg－1)后，糖尿病大鼠成模率高(85%)，死亡率低(6%)，并且在给药的6周过程中模型组大鼠血糖稳定在15 mmol·L－1左右，只有1例大鼠出现血糖自行恢复的现象。因此可认为本实验成功建立了2型糖尿病模型。

GHb是血红蛋白与糖类经非酶促结合而生成的。它的合成过程缓慢且相对不可逆，贯穿于红细胞整个生命期当中(120 d)，其合成速率与红细胞所处环境中的糖浓度成正比，因此，GHb所占比率能反映测定点之前1～2个月甚至更长时间内的平均血糖水平，它可以作为观察糖尿病血糖控制水平及抗糖尿病药物效应的指标［5］。GSP是一类类似果糖胺的物质，是血浆中蛋白质与葡萄糖非酶糖化过程中形成的一种高分子酮胺结构，其浓度与血糖水平呈正相关，并保持相对稳定。由于血浆白蛋白的半衰期为17～20 d，故GSP反映的是测定前1～3周内血糖的平均水平［6］。GHb不仅是糖尿病有效血糖控制的“金指标”，而且对于心血管疾病、糖尿病肾病、白内障等疾病的预防和治疗有非常重要的意义。GSP从一定程度上弥补了GHb不能反映较短时期内血糖浓度变化的不足，是鉴别应激性血糖升高和糖尿病的有效指标之一。本实验结果显示，番石榴叶总三萜治疗组动物在给药6周后的GHb虽呈下降趋势，但并无统计学意义。而从GSP的结果看，番石榴叶总三萜给药组动物与模型组相比均显著下降。此结果提示番石榴叶总三萜可能需要给药3～4周后才能发挥显著降血糖效果。

胰岛素具有促进脂蛋白分解的作用，当胰岛素分泌不足或体内产生胰岛素抵抗时，机体血液中的甘油三酯、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白明显升高，引起脂质代谢异常［7－8］。高血糖加高血脂可明显加速糖尿病并发症的发生及其进展［9］。因此，纠正2型糖尿病的脂代谢紊乱，对于减少糖尿病并发症的发生发展有着重要的意义。本实验发现，番石榴叶总三萜可显著降低糖尿病大鼠血清甘油三酯、总胆固醇及游离脂肪酸水平，提示番石榴叶总三萜能明显改善脂代谢紊乱，可能对改善胰岛素抵抗及防治糖尿病伴发的高脂血症具有重要意义。

胰岛素抵抗在2型糖尿病发生、发展中起重要作用，改善胰岛素抵抗是治疗2型糖尿病的重要策略。PPARγ是PPAR核受体超家族成员之一，可在骨骼肌、肝细胞和脂肪组织中表达，是调节脂肪、葡萄糖的配体活化型核受体。噻唑烷二酮类(thiazolidinediones，TZDs)药物是目前临床主要的改善胰岛素抵抗、增加胰岛素敏感性的药物，它是一类高选择性PPARγ的激动药，进入靶细胞后激活PPARγ核受体，调节胰岛素应答基因的转录，从而调控多种影响糖、脂代谢基因的转录，使胰岛素作用放大，增强胰岛素在外周组织的敏感性，减轻胰岛素抵抗，控制血糖水平［10－11］。本实验结果表明，TZDs药物罗格列酮能显著对抗糖尿病大鼠血糖、血脂的升高，升高胰岛素敏感指数以及脂肪组织PPARγ蛋白表达水平，此结果与文献报道一致［12］。同样，给予番石榴叶总三萜治疗后，糖尿病大鼠空腹血糖与模型组相比明显降低，而胰岛素含量明显回升，胰岛素敏感指数显著提高，并且呈现一定程度的剂量相关性。同时，脂肪组织PPARγ蛋白表达显著增加。上述结果提示番石榴叶总三萜的抗糖尿病作用机理可能与其提高脂肪组织PPARγ的表达，增加靶组织对胰岛素的敏感性有关。

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