葡萄籽原花青素对肾血管性高血压大鼠血管重塑的影响*

吴秀香， 张 妍， 孙柳青， 唐剑涛， 靳俊峰

(遵义医学院珠海校区1病理学与病理生理学教研室，2计算机教研室，广东珠海519041)

高血压病是严重危害人类健康的疾病之一。高血压病时会引起机体发生血流动力学等变化，导致血管重塑。血管重塑既是高血压病的一种重要病理特征，也是造成高血压病人发生重要脏器(心、肾、脑)损害的结构基础［1］。因此，如何减缓或逆转血管重塑，进而减少重要脏器的损伤，对于治疗高血压病，至关重要。我们前期实验结果表明［2］，葡萄籽原花青素(grape seed procyanidin，GSP)具有明显的降压作用，但其是否具有缓解或逆转高血压血管重塑的作用及机制如何，报道甚少。本实验通过建立肾血管性高血压(renovascular hypertension，RH)大鼠模型，观察GSP对肾性高血压时血管重塑的影响，并初步探讨其机制，以期为开发GSP成为治疗高血压病的理想新药进一步提供理论依据。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 清洁级雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠(180～200 g)，购自广东省医学实验动物中心，许可证号为SCXK(粤)2008－0002。

1.2 药品 GSP由天津尖峰天然产物研究开发有限公司惠赠，纯度≥95%;卡托普利(captopril)，中美上海施贵宝制药有限公司产品。

1.3 主要试剂和仪器 大鼠血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)酶联免疫分析试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。兔抗鼠肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF － α)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔Ⅱ抗(北京博奥森生物技术有限公司)。蛋白分子量标准(MBI);蛋白电泳仪(Bio－Rad);大鼠尾动脉收缩压(systolic blood pressure，SBP)测定装置、多道生理信号采集处理系统(RM6240型，成都仪器厂)。其余试剂为市售分析纯。

2 方法

2.1 RH大鼠模型复制、分组及给药方法 50只SD大鼠经称重和测量基础尾动脉SBP后，随机分为手术组和假手术组(对照组，control，n=7)。手术组43只大鼠按照先前的方法复制RH大鼠模型［2］。术后2周选取鼠尾动脉SBP≥130 mmHg的大鼠28只，进入本研究，随机分为4组:RH模型组(RH model);GSP高剂量治疗组(high GSP)、GSP低剂量治疗组(low GSP)和卡托普利阳性对照治疗组(captopril)，每组各7只。于模型复制成功后，治疗组大鼠每天灌胃给药1次，剂量分别为:high GSP 200 mg·kg－1·d－1，low GSP 50 mg·kg－1·d－1，captopril 30 mg·kg－1·d－1。对照组及RH模型组每天灌胃相同体积的蒸馏水，连续灌胃6周。

2.2 血管重塑形态学参数的测量 自主动脉弓下1 cm处剪取0.5 cm胸主动脉，用10%甲醛固定，常规石蜡包埋、切片(厚度为4 μm)，行HE染色，用Image－Pro Plus 6.0系统软件进行图像分析，在统一放大40倍的显微镜下，分别测量胸主动脉血管中膜厚度(media thickness，MT)和血管内径(luminal internal diameter，LD)，按顺时针方向测12个值取其平均值［3］，并计算 MT/LD。

2.3 胶原定性和半定量分析 石蜡切片进行Masson染色(平滑肌细胞染成红色，胶原纤维染成蓝色，细胞核染成蓝色)，每张切片取图5张，用Image－Pro Plus 6.0系统软件进行图像分析，计算出胶原面积与统计场面积的比值。

2.4 AngⅡ含量检测 术后6周，取大鼠腹主动脉制备10%的匀浆液，严格按照试剂盒说明书进行操作。

2.5 总蛋白的提取和Western blotting检测TNF－α蛋白的表达 取大鼠腹主动脉，按照质量体积比1∶9加入匀浆液(含组织蛋白抽提试剂，多种蛋白酶抑制剂cocktail)进行匀浆，加入等体积的2×上样缓冲液，煮沸10 min使蛋白变性，12 000 r/min 4℃离心5 min取上清液，BCA法(武汉博士德)测定样品的蛋白浓度。用上样缓冲液调整蛋白浓度，使各泳道的蛋白上样体积为10 μL(含蛋白20 μg)。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后转印至硝酸纤维膜上，经脱脂奶粉封闭、洗脱后加抗TNF－α抗体(1∶300)4℃孵育过夜，再加入相应Ⅱ抗(1∶2 500)摇床孵育80 min。洗脱后，加ECL发光显示剂，暗盒压片、曝光，显影、定影于胶片。胶片经照相后，用Bio－Rad提供的Quantity One软件进行灰度值分析，以实验各组蛋白条带平均灰度值与同一样品中内参蛋白条带的平均灰度值比值作为蛋白的相对含量。

3 统计学处理

结 果

1 各组大鼠尾动脉SBP的变化

灌胃治疗6周后，与对照组相比，RH模型组大鼠尾动脉SBP升高显著(P＜0.01);与RH模型组相比，2个不同剂量GSP灌胃的治疗组大鼠尾动脉SBP均降低，其中以GSP高剂量治疗组的降压效果尤为明显(P＜0.01)，与 captopril组的降压效果相当，与对照组相比无显著差异，见表1。

2 血管重塑形态学参数的变化

与对照组相比，RH模型组大鼠胸主动脉管壁增厚，管腔狭窄，MT和MT/LD明显增高(P＜0.01);各治疗组MT增厚和LD缩小的表现缓解，MT/LD增高的幅度下降;低剂量治疗组有上述作用(P＜0.05)，但MT和MT/LD仍高于对照组，LD仍小于对照组;高剂量治疗组的上述作用明显，与captopril治疗组的效果相当(P＜0.01)，与对照组没有显著差异，见图 1、表2。

表1 GSP对大鼠尾动脉SBP和腹主动脉组织中AngⅡ水平的影响Table 1.Effect of GSP on SBP and AngⅡ in the abdominal aorta of rats in each group(±s.n=7)

表1 GSP对大鼠尾动脉SBP和腹主动脉组织中AngⅡ水平的影响Table 1.Effect of GSP on SBP and AngⅡ in the abdominal aorta of rats in each group(±s.n=7)

＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs RH model.

Control —95.05 ±4.15 4 023.73 ±306.98 RH model — 144.07 ±7.00＊＊ 5 357.37 ±295.60＊＊Low GSP 50 134.14 ±11.95# 4 938.34 ±235.43#High GSP 200 107.01 ±5.51## 4 157.46 ±307.34##Captopril 30 105.10 ±4.97## 4 076.50 ±313.43##

Figure 1.The changes of morphological parameters of thoracic aorta remodeling of rats in each group(HE staining，×40).±s.n=7.A:control;B:RH model;C:GSP(50 mg/kg);D:GSP(200 mg/kg);E:captopril.图1 各组大鼠胸主动脉血管重塑形态学参数的变化

表2 各组大鼠胸主动脉血管重塑形态学参数的变化Table 2.The changes of morphological parameters of thoracic aorta remodeling of rats in each group(±s.n=7)

表2 各组大鼠胸主动脉血管重塑形态学参数的变化Table 2.The changes of morphological parameters of thoracic aorta remodeling of rats in each group(±s.n=7)

＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs RH model.

Group MT(μm) LD(μm)MT/LD Control 65.7±2.8 1 262.0±12.0 0.0520±0.0017 RH model 108.9±4.8＊＊ 1 044.0±12.1＊＊ 0.1040±0.0034＊＊GSP(50 mg/kg) 100.1±3.0# 1 077.0±12.8# 0.0930±0.0032##GSP(200 mg/kg) 71.2±3.2## 1 249.0±11.5## 0.0570±0.0021##Captopril 71.4±3.0## 1 249.0±9.5## 0.0570±0.0020##

3 各组大鼠胸主动脉胶原含量的变化

由图2可见，对照组大鼠胸主动脉平滑肌细胞间蓝色的胶原纤维较少，呈直线状，分布均匀。RH模型组大鼠主动脉平滑肌束间见大量蓝色的胶原纤维增生，弯曲排列;胶原面积和统计场总面积比值高于对照组。经GSP和卡托普利治疗后，大鼠胸主动脉平滑肌束间胶原纤维有不同程度的减少，胶原面积和统计场总面积比值亦明显降低。

4 各组大鼠腹主动脉组织中AngⅡ含量的变化

灌胃治疗6周后，RH模型组的大鼠血管组织中AngⅡ的含量显著高于对照组(P＜0.01);GSP治疗组大鼠血管组织中AngⅡ有所降低(P＜0.05)，但低剂量治疗组仍高于对照组，高剂量治疗组降低更显著，与captopril组治疗效果相当，与对照组没有显著差异，见表1。

Figure 2.Expression of collagen in abdominal aorta of rats in each group(Masson staining，×400).A:control;B:RH model;C:GSP(50 mg/kg);D:GSP(200 mg/kg);E:captopril.±s.n=7.＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs RH model.图2 各组大鼠腹主动脉胶原的表达

Figure 3.The expression of TNF－α protein detected by Western blotting.±s.n=7.＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P ＜0.01 vs RH model.图3 Western blotting检测TNF－α蛋白的表达

5 各组大鼠腹主动脉组织中TNF－α蛋白表达的变化

RH模型组TNF－α蛋白表达与对照组相比明显增多，各治疗组的TNF－α蛋白表达有不同程度的降低(low GSP组有降低作用，但是仍高于对照组;high GSP组降低作用十分显著，与captopril组的降低效果相当)，见图3。

讨 论

本实验结果显示，与对照组相比，RH模型组大鼠尾动脉SBP明显升高，胸主动脉中膜明显增厚，平滑肌肌束间胶原纤维明显增生，管腔内径变小，说明本实验成功复制了肾血管性高血压大鼠模型，且主动脉血管发生了重塑。应用GSP治疗后，能显著降低RH模型组大鼠尾动脉SBP(与我们先前的实验结果一致)，同时亦能明显减轻高血压大鼠胸主动脉的中膜增厚、管腔狭窄和胶原纤维的增生程度，即GSP在降压的同时，也能够明显抑制血管结构的改变，具有改善高血压血管重塑的作用。鉴于近年来高血压临床治疗目标已从过去的仅限于控制血压水平，到现在提高到逆转血管重塑的高度［4］这一新理念，本实验结果对于开发GSP成为治疗高血压病的理想药物提供了新的理论依据。

血管活性物质如AngⅡ的促血管重塑作用是近年研究的热点［5］。AngⅡ可通过某些生长因子或炎症因子的介导，刺激胶原纤维增生和细胞外基质沉积，加速血管平滑肌细胞的生长发育，促进高血压血管重塑的形成［6－7］。此外，AngⅡ还可以促进核酸合成，调控某些基因表达，刺激血管增殖［8］;通过激活氧化还原敏感通路以及转录因子来诱导整合素、黏连分子、细胞因子以及促生长和纤维化催化剂的合成，发挥促炎症和促血管重塑的作用［7］。本研究结果显示，与对照组相比，RH模型组大鼠血管中AngⅡ含量明显增高，经GSP治疗后，AngⅡ含量有所降低，且血管重塑的形态学参数变化减小，提示GSP可通过抑制AngⅡ的生成，减轻高血压的血管重塑。

TNF－α是人体内最重要的炎症细胞因子之一，近年来发现其与高血压心血管重塑密切相关。TNF－α可使自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞的增殖从G1期进入S期更快(与WKY大鼠相比)，从而可促进血管平滑肌细胞增殖，调节动脉壁厚度［9］;TNF－α能促进IL－1的分泌(IL－1可以促进血管平滑肌增殖，使血管壁增厚，管腔变小)及AngⅡ的释放，使血管发生重塑;也可通过促进内皮细胞c－sis、cmyc和c－fos等原癌基因的异常表达，增加内皮素表达，从而导致DNA合成增加，使血管壁增厚，管腔缩小，外周阻力增加，动脉顺应性减退［10－11］。本实验应用Western blotting检测大鼠主动脉TNF－α的表达，结果发现GSP能明显降低RH模型组大鼠主动脉中TNF－α的高表达，降低效果与阳性对照药captopril相当，提示，GSP亦可通过抑制血管组织中促炎因子TNF－α的表达，发挥抗高血压血管重塑作用。

总之，本实验结果表明GSP在降压的同时，还可以通过降低血管组织中AngⅡ的含量和TNF－α的蛋白表达，以减轻高血压的血管重塑。鉴于GSP具有多种药理活性，其抗高血压血管重塑的其它机制有待进一步探讨。

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