胎鼠间充质干细胞移植缓解小鼠体力疲劳的研究*

2012-01-30刘成成祝爱珍周艳华刘革修何冬梅谭广销陈卓铭

中国病理生理杂志 2012年9期

刘成成，祝爱珍，周艳华，刘革修，何冬梅，谭广销，陈卓铭

(暨南大学1医学院血液病研究所，2附属第一医院康复科，广东广州510632)

抗疲劳一直以来是研究的热点，已有研究报道显示，许多天然物质可以有效缓解和抵抗疲劳，如辣椒碱，可升高血液中儿茶酚胺的浓度，延长小鼠耐力［1］;茶多酚，可促进脂肪燃烧，降低运动所致的氧化应激，缓解体力疲劳［2］;红景天苷，通过影响运动过程中自由基的生成和能量代谢起到抗疲劳作用［3］。但这些物质是否能应用于临床仍需进一步研究。间充质干细胞是一类具有多种分向潜能的细胞，作为基质细胞中的一种，可以分泌各种细胞因子和生长因子［4］，具有自我复制、免疫调控及促进造血干细胞植入等特点［5－6］，临床上已有尝试将脐带间充质干细胞用于重症肌无力患者，有患者表现出明显的临床缓解，但至今没有研究报道能解释这一现象，也未有间充质干细胞在缓解、抵抗体力疲劳方面的研究，因此，本研究目的是为了明确间充质干细胞在动物体内的抗疲劳作用并探讨其作用机制。

材料和方法

1 材料

1.1 动物孕13.5d BALB/c小鼠4只、6月龄雌性BALB/c纯系小鼠90只，SPF级，体重(20±2)g，购自广东省医学实验动物中心，动物合格证号:(粤)2008－0002，所有动物实验均按照中国科学技术委员会颁发的实验动物管理条例执行，在无菌条件下饲养。

1.2 主要试剂 DMEM/F12培养基、胶原酶Ⅳ和胰蛋白酶均购自Gibco;胎牛血清购自HyClone;血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血乳酸(blood lactic acid，BLA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、肝糖原和肌糖原测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;Vevo770®高分辨率小动物超声系统购自Visual Sonics。

2 方法

2.1 MSCs的分离培养引颈处死孕13.5d BALB/c小鼠，体积分数75%乙醇消毒，无菌取出胎鼠，去除胎鼠头、尾、四肢及内脏，PBS洗涤数次，于37℃、0.1%胶原酶Ⅳ消化获得细胞悬液，200目筛网过滤，收集细胞离心，PBS洗涤3次，以1×109/L密度接种于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM/F12完全培养基的培养瓶中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，24 h后全量换液，弃非贴壁细胞。细胞融合达80%，用0.25%胰酶消化，按1∶3传代;P5代细胞进行流式细胞术和成骨成脂分化鉴定。

2.2 MSCs移植 86只小鼠随机分为3组，安静对照(nonswimming)组18只，单纯运动(swimming control)组34只，MSCs+运动(swimming+MSCs)组34只，其中MSCs运动组尾静脉输注第5代MSCs(每只5×106)进行干预，安静对照组和单纯运动组输注同体积生理盐水1 mL。

2.3 负重游泳试验单纯运动组和MSCs运动组各8只小鼠，于移植MSCs 24 h后进行负重游泳试验，游泳箱水深38 cm，水温保持在(25.0±0.5)℃，小鼠尾根部负荷5%体重的铅皮，记录小鼠从游泳开始至力竭的时间(即小鼠失去协调运动，10 s内没能浮出水面的时点)，实验结束后，将小鼠取出，毛巾拭干。

2.4 血尿素氮、肝糖原、肌糖原水平及各组织中SOD活性、MDA含量的测定安静对照组、单纯运动组和MSCs+运动组各18只小鼠，于移植MSCs 24 h后，在水深38 cm，水温(25±0.5)℃的游泳箱里游泳60 min后，一部分小鼠用于测定各项生化指标，另一部分用于检测心功能。戊巴比妥钠麻醉小鼠后，内眦静脉迅速取血0.5 mL，待血液凝固后离心，测定血尿素氮的含量。取脑组织、肝脏、股四头肌，液氮冰冻，－80℃保存，待测时按试剂盒说明书检测肝糖原、肌糖原水平、SOD活性和MDA含量。

2.5 心功能的评估用于检测心功能的小鼠游泳60 min后休息30 min，Vevo770®高分辨率小动物超声系统检测小鼠运动后的心脏功能，超声测量指标为:(1)心率(heart rate，HR);(2)每搏输出量(stroke volume，SV)，根据主动脉瓣血流速度－时间积分(velocity－time integral，VTIa)计算SV，计算公式为SV=VTIa×ACSA，其中ACSA为在胸骨旁长轴切面所测主动脉瓣环水平的横切面积;(3)心输出量(cardiac output，CO)，指每分钟左心室排出的血流量，即 CO=SV×HR;(4)左室舒张期容积(left ventricular diastolic volume，LVDV)。

2.6 血乳酸含量测定单纯运动组和MSCs+运动组各8只小鼠在水深38 cm，水温(25±0.5)℃，水流8 L/min的游泳箱里游泳10 min，分别于游泳前、游泳后0、10 min尾静脉各取血20 μL，于系统稀释液中，血乳酸分析仪测定各组血乳酸的含量［7］。

3 统计学处理

结果

1 MSCs体外培养的生物学特点

原代胎鼠细胞呈梭型、多角形贴壁生长，散在、集落式分布，传代后的细胞主要呈长梭形，形态较原代均一，呈漩涡状生长，见图1。第5代细胞经流式细胞术检测，表达CD44和CD105，不表达造血干细胞标志CD34和CD45，能向成骨细胞或脂肪细胞分化，具备MSCs基本特点。成骨诱导实验结果见图2，可见被茜素红染色的钙结节。成脂诱导实验结果见图3，可见胞浆中有红色脂滴。

Figure 1.Morphology of MSCs of the fifth passage(×40).图1 第5代胎鼠MSCs形态学观察

Figure 2.Alizarin red staining of MSCs following osteogenic induction(×200).图2 MSCs的成骨分化

Figure 3.Oil red O staining of MSCs following adipogenic induction(×200).图3 MSCs的成脂分化

2 实验小鼠一般情况观察

移植MSCs后的小鼠变得活泼好动，食欲略有增加，精神状态较未移植MSCs的小鼠要好。

3 MSCs对小鼠负重游泳时间的影响

移植MSCs 24 h后，MSCs+运动组小鼠负重游泳时间为(1 890±83)s，与单纯运动组［(1 228±72)s］相比有所增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。这说明移植MSCs能显著延长小鼠负重游泳时间，缓解体力疲劳，提高运动耐力。

4 MSCs对体力疲劳小鼠各项生化指标的影响

4.1 血尿素氮、肝糖原和肌糖原含量变化小鼠进行游泳试验后测定各项生化指标，MSCs+运动组小鼠运动后血尿素氮明显低于单纯运动组，虽然较安静对照组有所升高，但升高的幅度较小，而单纯运动组小鼠在运动后血尿素氮较安静对照组明显升高;MSCs+运动组小鼠肝糖原和肌糖原含量较单纯运动组显著提高，而单纯运动组小鼠在游泳实验后，与安静对照组相比肝糖原和肌糖原均显著下降，见表1，说明MSCs移植能减少小鼠机体内蛋白质的氧化供能，降低血尿素氮的生成，增加肝糖原和肌糖原的合成，能源物质储备增加，则耐力运动更为持久。

表1 移植MSCs对体力疲劳的鼠生化指标的影响Table 1.Effects of MSC transplantation on the levels of biochemical indexes in fatigue mice(±s.n=8)

*P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01 vs non － swimming group;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs swimming control group.

Glycogen(mg/g)Liver Muscle Non－swimming 6.41±1.65 27.49±1.74 5.12±1.09 Group BUN(mmol/L)Swimming control 11.73±1.86## 14.63±1.58## 3.34±0.96*Swimming+MSCs 7.96±1.58＊△ 24.92±1.94＊△△ 4.85±0.84△

4.2 各组织SOD活性和MDA含量与单纯运动组比较，MSCs+运动组肝脏、肌肉组织和脑组织SOD活性升高，说明移植MSCs提高了机体的抗氧化能力。单纯运动组肝脏和肌肉组织中MDA含量较安静对照组有所升高，但脑组织变化不明显，说明脑组织具有一套完善的自身调控体系，而MSCs+运动组肝脏和肌肉组织MDA含量均较单纯运动组低，且接近安静对照组，见表2，说明移植MSCs能减少MDA的生成。

表2 移植MSCs对体力疲劳的小鼠各组织MDA含量、SOD活性的影响Table 2.Effects of MSC transplantation on MDA level and SOD activity in fatigue mice(±s.n=8)

*P ＜0.05，##P ＜0.01 vs non －swimming group;△P ＜0.05 vs swimming control group.

)］Brain Liver Muscle Brain Liver Muscle Non － swimming 1.07 ±0.24 1.89 ±0.22 1.79 ±0.23 Group MDA［μmol/(g protein )］SOD［103U/(g protein 1.35 ±0.32 4.69 ±0.89 1.15 ±0.25 Swimming control 1.13 ±0.12 3.07 ±0.26* 2.59 ±0.15* 1.87 ±0.24* 5.87 ±0.67## 1.68 ±0.17*Swimming+MSCs 1.06 ±0.20 2.15 ±0.29＊△ 1.97 ±0.23△ 1.95 ±0.19* 7.72 ±0.72＊△ 1.89 ±0.30△

5 MSCs对小鼠心功能的影响

在小鼠体力疲劳的状态下测量心脏功能各项指标，结果显示MSCs运动组小鼠心脏室壁结构几乎没有变化，但心脏输出量、每搏输出量、左室舒张期容积均较单纯运动组小鼠高，心率较单纯运动组低，说明MSCs移植能改善心功能，增强心脏泵血，使运动过程中相关组织器官血供增加，延长耐力运动时间，见表3。

表3 小鼠心脏超声结果比较Table 3.Comparison of echocardiography of the mice among the 3 groups(±s.n=10)

*P ＜0.05 vs swimming control group.

Group Heart rate(min－1) Stroke volume(μL) Cardiac output(mL/min) Left ventricular diastolic volume(μL)Non － swimming 383.00 ±9.55 49.54 ±17.12 18.97±4.82 52.98 ±10.05 Swimming control 411.39 ±11.06 50.39 ±16.73 20.73 ±4.26 53.56 ±9.64 Swimming+MSCs 405.04 ±12.47 54.71 ±14.59* 22.16 ±3.25* 54.93 ±9.36*

6 MSCs对小鼠运动前后血乳酸的影响

在水流8 L/min的游泳箱里游泳10 min后，单纯运动组小鼠血乳酸较运动前明显增加，休息10 min后血乳酸水平有所下降，但仍高于运动前;MSCs+运动组小鼠运动后血乳酸含量也有升高，但较单纯运动组低，且差异有统计学意义(P＜0.05)，休息10 min后MSCs+运动组小鼠血乳酸下降明显，接近运动前的数值，说明移植MSCs能减少小鼠运动后血乳酸的堆积，促进乳酸分解，对延缓运动性疲劳具有积极作用，见表4。

表4 移植MSCs对小鼠运动过程中血乳酸的影响Table 4.Effect of MSC transplantation on blood lactic acid level in mice(mmol/L.±s.n=8)

#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs swimming control group.

Group Before swimming 0 min after swimming 10 min after swimming Swimming control 3.86±0.39 7.16±0.63 6.26±0.52 Swimming+MSCs 3.67±0.41 6.45±0.42# 4.37±0.43##

讨论

运动能力除了直接与骨骼肌功能密切相关外，还与机体心肺功能有着密切关系。心肺系统功能越强则供应的营养和氧气越多，一方面可以增加有氧代谢以最大限度满足肌肉的能量需要，进而减少乳酸的生成、并促进其排出以减少堆积，另一方面则减少糖原和蛋白质的消耗，增加肝糖原和肌糖原的储备［8］，减少血清尿素氮的生成。

本研究结果不仅证实了移植胎鼠MSCs可以延长小鼠负重游泳时间，缓解体力疲劳，增强运动耐力，而且进一步分析了其机制:移植MSCs明显增强小鼠的心功能，同时降低血尿素氮和血乳酸水平，增加肝糖原和肌糖原储备等。该研究结果可能与MSCs独特的生物学活性有关，即MSCs不仅具有多向分化潜能，而且可分泌多种细胞因子和生长因子［9］。胎鼠间质干细胞作为干细胞中的一种，较成体干细胞原始，具有更强的增殖和分化潜能，且免疫原性低，不易发生排斥反应，能更好地发挥其作用。本课题组已有研究显示通过移植胎鼠间充质干细胞可以延缓机体衰老、改善心脏功能［10］，结合课题组前期报道结果，则可以进一步解析研究中心功能增强的原因。目前有大量研究资料显示，MSCs不仅可以分化为肺上皮细胞，而且可以分泌多种因子，促进肺毛细血管的再生，这些均能改善机体肺功能［11－12］。心肺功能增强则为运动时提供了足够的氧和能量，增加了有氧代谢，减少糖酵解的无氧代谢，增加能量的有效利用，相应地减少了乳酸的生成、降低糖原和蛋白质的消耗，增加肝糖原和肌糖原储备，减少血尿素氮和MDA的生成，有利于维持机体机能状态、增加其运动耐力。心肺功能增强，血液循环加快，还可以增加肝脏等重要脏器供血，增强肝脏合成各种能源物质的能力，如肝糖原、肌糖原，促进了有害代谢产物的分解，如血尿素氮、肌肉和肝脏的MDA、血乳酸等，同时可以减少组织细胞缺氧损伤，这些都有利于缓解体力疲劳，提高机体耐力。

移植MSCs使得小鼠心肺系统功能得到整体改善，机体耐力更持久。再者，有文献资料显示，移植MSCs可使得小鼠体内SOD活性增强，清除氧自由基、抗氧化的能力增强，与本研究结果一致，这从另一个方面也缓解了体力疲劳。

总之，本研究结果为现今指导临床上肌无力患者的治疗以及缓解中老年体弱者疲劳提供了重要的实验依据。

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