黄连解毒汤体外抗菌活性研究

曾雪花 周桂保 杨湘江 廖剑新

1.广东省深圳市龙岗中心医院，广东深圳 518116；2.广东医学院药学院，广东东莞 523000

黄连解毒汤首载于晋·葛洪《肘后备急方》，但未出方名；唐·王焘《外台秘要》引崔氏方，始冠名为黄连解毒汤，是由黄连、黄芩、黄柏、栀子四味中药按 3∶2∶2∶3 比例配伍组成的清热解毒方剂，具有清热、泻火、解毒之功效，主要治疗实热火毒、三焦热盛之证。黄连解毒汤方剂中以黄连泻心火、兼泻中焦之火为君，黄芩清肺热、泻上焦之火为臣，黄柏泻下焦之火、栀子通泻三焦之火合为佐使[1]。其中，黄连、黄芩、黄柏及栀子都有不同程度的抗菌作用。本文旨在研究黄连解毒汤在体外对不同细菌的抗菌活性，为其临床应用提供一定的实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；净化工作台（蚌埠净化设备厂）；DHG-9125A电热恒温鼓风干燥箱（上海柏欣仪器设备厂）；G154DW自动压力蒸汽灭菌器（致微仪器有限公司）；AND GH-202电子天平 （日本A&D公司）；麦氏比浊管（北京天安联合科技有限公司）。

1.2 试药

中药饮片黄连、黄芩、黄柏及栀子（深圳一致药业股份有限公司药材加工厂）；营养肉汤、营养琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司）；金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、福氏志贺菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌及伤寒沙门菌（深圳市龙岗中心医院微生物室提供）。

2 方法与结果

2.1 黄连解毒汤的制备[2]

分别称取中药饮片黄连、黄芩、黄柏和栀子 9、6、6、9 g（质量比为 3∶2∶2∶3）混合，加 10 倍量的纯化水浸泡 30 min，煎煮60 min，8层纱布滤过，药渣再加5倍纯化水煎煮60 min，8层纱布滤过，将两次煎煮滤液合并、离心后浓缩为10 mL，即每1 mL浓缩液相当于原生药3 g。将浓缩液作为黄连解毒汤储备液置100℃，20 min饱和蒸汽高压灭菌后，4℃条件下保存，实验时，用营养肉汤稀释至适宜浓度。

2.2 供试菌液的制备[3-4]

将传代纯化的实验菌接种于营养肉汤中，37℃培养24 h，菌液用3 mL营养肉汤校正浓度至0.5 cfu，作为供试菌液。

2.3 最低抑菌浓度（MIC）测定及结果

采用连续倍比试管稀释法，取营养肉汤培养基按照说明书配制好后，分装于8根试管中并编号，1号试管加入4 mL营养肉汤培养基，2～8号试管每管均加3 mL营养肉汤培养基，于121℃，15 min高压灭菌后备用。吸取黄连解毒汤2 mL加入1号试管中充分摇匀，浓度为1 000 mg/L，从1号试管内吸取3 mL药液置2号试管中，充分混匀，3～6号试管采用该法依次倍比稀释 1/4、1/8、1/16、1/32，使 1～6 号试管药液浓度依次为 1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5、31.25 mg/L；然后每根试管加入0.3 mL供试菌液。同时，7号试管加入0.3 mL灭菌营养肉汤培养基作为空白对照组，8号试管加入0.3 mL供试菌液作为阳性对照组。将1～8号试管充分摇匀后，置于37℃恒温培养24 h，观察各试管培养液的混浊情况，以未出现混浊即未见供试菌生长的最低药物浓度为黄连解毒汤对该菌株的MIC。结果显示，黄连解毒汤在体外对副溶血弧菌的MIC为62.5 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC为125.0 mg/mL；对福氏志贺菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌及伤寒沙门菌的MIC均＞1 000 mg/mL；空白对照组均未见肉眼可见浑浊，阳性对照组均可见浑浊。见表1。

表1 不同浓度黄连解毒汤对供试菌抑菌作用测定结果（mg/mL）

2.4 最低杀菌浓度（MBC）测定及结果

取营养琼脂培养基按照说明书制备营养琼脂平板培养基若干，于121℃，15 min高压灭菌后，吸取MIC终点浓度以上未见生长细菌培养液0.1 mL加至0.9 mL营养肉汤培养液中，混匀使药液浓度稀释为原来的1/10，然后吸取0.1 mL稀释液均匀涂布于营养琼脂平板培养基上，同时设置加0.1 mL营养肉汤培养液组作为空白对照组，加0.1 mL供试菌液组作为阳性对照组，均置于37℃恒温培养箱中培养24 h，观察平板培养基有无细菌生长，培养基中无细菌生长的最低浓度为黄连解毒汤的MBC。结果表明，黄连解毒汤在体外对副溶血弧菌的MBC为125.0 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MBC为125.0 mg/mL；空白对照组均未见细菌生长，阳性对照组均可见细菌生长。具体见表2。

表2 黄连解毒汤对供试菌的MIC、MBC测定结果（mg/mL）

3 讨论

黄连解毒汤是中医清热解毒方中的经典方剂，现代药理学研究表明[5-10]，黄连解毒汤具有多种药理活性，如抗氧化，抗肿瘤，抗血栓，调节血糖，抗炎作用及抗菌作用等。本研究旨在初步了解黄连解毒汤的抗菌谱，并进一步探讨其对敏感菌的抗菌活性大小。

本研究按照黄连解毒汤的传统煎煮方法，考虑煎煮时间的影响[2]，将煎煮时间规定为60 min。研究发现，黄连解毒汤对金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌体外较敏感，MIC分别为125.0、62.5 mg/mL，MBC 均为 125.0 mg/mL；对福氏志贺菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌及伤寒沙门菌的抑菌作用不明显，MIC均＞1 000 mg/mL。实验结果提示，黄连解毒汤对细菌的抗菌作用具有一定的选择性，对金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌的抗菌活性明显强于福氏志贺菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌及伤寒沙门菌。

黄连解毒汤成分研究表明[11-14]，黄连解毒汤主要含有生物碱、黄酮及环烯醚萜苷三大类成分。其中，生物碱主要为小檗碱、巴马亭、药根碱；黄酮类主要有黄芩苷、汉黄芩素及木犀草素等；环烯醚萜类主要为栀子苷。小檗碱作为黄连解毒汤的主要有效成分，具有抗菌、调节血脂血糖等多种药理作用，特别是因为其广谱抗菌活性，已被临床应用于金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等所致的胃肠道感染的治疗[15-17]。本研究发现，黄连解毒汤的抗菌活性具有一定选择性，与小檗碱的抗菌谱存在一定差异。提示，中药汤剂成分复杂，很难用一种成分解释某种药理活性；同时，黄连解毒汤还可能存在其他抗菌活性的化学成分有待进一步研究。

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