凝胶渗透色谱－气相色谱－质谱联用快速测定大豆中克百威、乙草胺、甲草胺、异丙甲草胺、氟乐灵的残留量

苏明明，张旭东，那 晗，王 琦，宋大贺，张 宁

（1.大连出入境检验检疫局，辽宁 大连 116001；2.锦州出入境检验检疫局，辽宁 锦州 121013；3.大窑湾出入境检验检疫局，辽宁 大连 116001；4.辽宁出入境检验检疫局，辽宁 大连 116100；5.大连机场检验检疫局，辽宁 大连 116100）

大豆是重要的油料和蛋白来源，是我国大宗进口的农产品之一。克百威具有高活性、高效、低毒及易分解的特性，在世界范围内被广泛用于保护农作物免受虫害。克百威是氨基甲酸酯类农药，在高温中具有热不稳定性，在气相色谱分析过程中，需同时测定克百威本体和其分解产物3－羟基克百威。目前，相关文献的报道较多，但其主要缺点在于操作复杂、灵敏度低等[1－4]，采用GC/MS法不仅可以同时进行克百威的定量测定和阳性确证，还可以提高测定的灵敏度及精确度。由于豆田中杂草繁多，氟乐灵、甲草胺、异丙甲草胺和乙草胺是大豆田常用的4种除草剂，主要用于防除禾本科杂草和一些阔叶杂草，每亩的登记施用剂量均小于100g（有效成分）。我国规定大豆中异丙甲草胺的残留限量为0.02 mg/kg，氟乐灵的残留限量为0.05mg/kg，甲草胺和乙草胺的残留限量皆为0.2mg/kg。由于大豆中油脂类物质含量较高，净化困难，试样需采用凝胶渗透色谱（GPC）法去除色素和油脂。凝胶渗透色谱作为一种新的净化方法和技术，在国外已广泛使用[5－6]，在我国的运用也日渐增多[7－10]。本研究采用凝胶渗透色谱－气相色谱－质谱（GPC－GC/MS）法同时检测大豆中氟乐灵、克百威、异丙甲草胺、甲草胺和乙草胺的残留量，去除了油脂类物质的干扰，同时进行定量测定和阳性确证，希望能为大豆中5种农药残留的检测提供新的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

6890－5975C气相色谱－质谱仪：美国Agilent公司产品，配有7683B自动进样器和分流/不分流进样口；EI源及数据处理系统；Ultratur－Rax均质器，旋转蒸发仪：德国IKA公司产品；离心机 RJ－TDL－40B：中国瑞江公司产品；移液枪（100～1 000μL）：美国 Thermo公司产品；J2 AccuPrepMPS凝胶净化色谱仪：美国J2公司产品。

克百威、乙草胺、甲草胺、异丙甲草胺和氟乐灵（质量浓度均为100mg/L）：购自国家环境保护监测研究中心；流动相为V（环己烷）∶V（乙酸乙酯）＝1∶1的溶液；正己烷、乙腈、乙酸乙酯和环己烷均为分析纯，经重蒸馏后使用。

1.2 气相色谱－质谱条件

1.2.1 气相色谱条件 色谱柱：HP－5MS石英毛细柱（30m×0.25mm×0.25μm）；升温程序：80℃保持1min，以15℃/min升至270℃，保持10min；载气（高纯氦气）流速1.2mL/min；压力2.4kPa；进样口温度270℃；进样量1μL；不分流进样。

1.2.2 质谱条件 电子轰击（EI）离子源；电子能量70eV；离子源温度150℃，四极杆温度230℃，色谱－质谱接口温度280℃；全扫描范围m/z 50～450用于测定样品净化效果，选择离子监测用于定性和定量测定。

用乙草胺等5种农药的混合标准溶液，在上述GC/MS条件下用Scan方式先测得其总离子流图，然后根据各农药的保留时间和质谱图，确定各待测化合物在SIM测定方式中的采集时间和监测离子，列于表1。

1.3 凝胶色谱（GPC）净化

1.3.1 凝胶色谱条件 Bio Beads S－X3净化柱：700mm×25mm；流动相：V（环己烷）∶V（乙酸乙酯）＝1∶1的混合溶液；流速：5.0 mL/min；样品定量：5.0mL；预淋洗体积：50 mL；洗脱体积：200mL；收集体积：50mL。

表1 GC/MS－SIM法分析5种农药的采集时间和监测离子Table 1 End acquisition time and monitoring ion of GC/MS－SIM analysis for 5pesiticides

1.3.2 凝胶色谱净化步骤 将10mL待净化液按1.3.1进行净化，合并馏分收集器中的收集液于250mL浓缩瓶中。

1.4 分析步骤

将大豆研碎，准确称取5.0g粉碎样品，加入50mL乙腈，均质2min，以4 000r/min离心10min，取乙腈层转入100mL梨形瓶，再加入20mL乙腈重复上述提取1次，合并，于旋转式蒸发仪中浓缩至干，加入10mL V（乙酸乙酯）∶V（环己烷）＝1∶1的混合溶液定容，过0.45μm滤膜后，用GPC净化。收集5～15min馏分，浓缩近干，用正己烷定容至5mL，待测。

2 结果与讨论

2.1 GPC净化方式

大豆及一些豆制品中含有大量的油脂和蛋白质等物质，当前最为常用的传统经典提取方法有液－液分配法、层析法、凝结沉淀法、冷冻法、化学法、薄层色谱法、扫集共蒸馏法[11－13]等。如果样品直接提取进样难以除去大豆及其制品中的油脂，对色谱分析会产生一些干扰，影响定性定量分析的准确性。本实验使用GPC进行净化浓缩，通过对仪器条件的改进，实现了加压和收集特定馏分的目的，同时也缩短了试样净化的时间。由于GPC是依靠被分离物质本身相对分子质量的大小对样品进行分离的，凝胶本身与被分离试样之间没有相互作用，因此被分离物质在分离过程中不会发生化学变化。在GPC中，大分子物质将首先被洗脱出来，如油脂、类脂化合物、聚合物、蛋白质、色素及类固醇等，而小分子物质（如农药等）则扩散进入凝胶孔内，较迟流出色谱柱。GPC的条件温和，对农药的性质没有特殊要求，不同类型的农药可同时分析，再加上在一个固定的淋洗系统中，凝胶可以被反复使用，所以利用Bio－Beads S－X3凝胶填料净化样本中的残留农药，不但技术成熟、廉价，而且重现性高、净化和回收效果良好[10]。

2.2 监测离子的选择

在SIM测定方式中，根据各化合物的质谱图，选择2～3个有足够相对强度的离子作为选择监测离子碎片用于定量测定和阳性确证。如果分子离子峰有足够的相对强度（一般大于50%），则首选分子离子峰；其次是m/z＞100的基峰或者是相对强度较大的其它离子碎片。

另外，克百威是氨基甲酸酯类农药，在高温中具有热不稳定性，克百威有两个峰出现，即克百威和其酚的代谢产物3－羟基克百威，所以克百威的测定结果为两者之和，在SIM测定方式中设定3－羟基克百威的采集时间和监测离子[14]。GC/MS－SIM 测定方式下5种农药的选择离子流色谱图示于图1。

图1 GC/MS－SIM测定方式下5种农药（0.1mg/L）的总离子流图Fig.1 GC/MS－SIM ion monitoring chromatograms of 5pesticides

2.3 标准工作曲线的绘制

根据各农药的检测灵敏度，取1.1节中的农药标准储备液，用正己烷逐级稀释，配制成5种农药的混合标准工作曲线。其中，克百威的浓度为0.005、0.01、0.025、0.1、0.2mg/L，甲草胺的浓度为0.01、0.025、0.05、0.1、0.2mg/L，乙草胺的浓度为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2mg/L，异丙甲草胺的浓度为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/L，氟乐灵的浓度为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2mg/L，在1.2节的 GC/MS－SIM 条件进行测定。结果表明，各组分的浓度与峰面积的线性关系良好，相关系数为0.996 0～0.999 8，列于表2。

表2 标准曲线Table 2 Standard curve of detection

2.4 方法的回收率和精密度

将大豆样品粉碎后，在大豆粉末中添加克百威、氟乐灵、甲草胺、异丙甲草胺和乙草胺进行回收率试验，每个添加浓度重复6次，得出农药回收率为66.26%～104.9%，相对标准偏差为2.2%～12.3%。本试验在标准添加的最低质量浓度为0.01mg/L，5种农药的信噪比均大于10，并有较好的回收率，故确定各农药定量限为0.01mg/L，结果列于表3。

表3 5种农药样品的加标回收率及精密度Table 3 Recoveries and precisions of 5pesticides at different spiked concentrations

2.5 实样检测

自2010年4月以来，采用本方法检测了大量的大豆样品。对其中一批阳性样品进行5次重复测定，结果为乙草胺，平均值为0.03 mg/kg，相对标准偏差为3.7%，其对应的色谱图示于图2～4。

图2 空白大豆样品总离子色谱图Fig.2 SIM chromatograms of soybean sample

图3 阳性大豆样品总离子色谱图Fig.3 SIM chromatograms of positive soybean sample

图4 0.1mg/L乙草胺标准溶液的总离子色谱图Fig.4 SIM chromatograms of 0.1mg/L acetochlor

3 结论

虽然检测大豆中克百威、异丙甲草胺、氟乐灵、甲草胺和乙草胺的农药残留已有国家标准和其他检测方法[15－18]，但需要对5种农药分别进行检测，花费时间比较长。GPC结合GC/MS－SIM法可以对大豆中5种农药残留同时进行定量测定和阳性确证，达到了一举两得，事半功倍的效果，避免了气相色谱法中当干扰物的保留时间与被测物非常接近时而引起的阳性判断错误。GC/MS法中的SIM测定方式基线噪声小、干扰少、具有与GC－FPD或GC－NPD法相当或者更高的灵敏度；测定克百威、异丙甲草胺、氟乐灵、甲草胺和乙草胺5种农药残留的检出限量完全可以满足检测要求。

试样用乙腈提取，GPC进行前处理，回收率、精密度较好、简捷、快速，适用于在短时间内大批量样品的分析。

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