LC－MS/MS和荧光偏振法监测环孢素A血药浓度的相关性研究

王 波，李鹏飞，马 萍，王 燕，刘丽宏

（1.第二炮兵总医院药学部，北京 100088；2.泰山医学院药学院，山东 泰安 271016）

环孢素A（CyclosporinA，CsA）是一种强效免疫抑制剂，在临床上主要用于器官移植的抗排异反应和移植物抗宿主病，近年来也用于治疗再生障碍性贫血、血小板减少性紫癜、狼疮肾炎等多种难治性自身免疫性疾病[1]。由于CsA的生物利用度和药动学个体差异大、治疗窗窄，血药浓度过高将引起肝肾毒性，过低则发生排异反应。因此，监测CsA血药浓度，并调整其浓度在有效范围内，具有重要的临床意义。

治疗药物监测作为临床应用CsA的前提条件是公认的准则。目前，国内外常用的CsA监测方法有荧光偏振法（TDx）、AxSYM免疫分析法、CEDIA克隆化酶供体免疫分析法、Emit均相酶测免疫分析法、高相液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱－质谱联用法（LC－MS/MS）等[2－7]。关于各种测定方法之间的比较，国内外均有报道[3－6]。TDx法对环孢素的体内代谢产物产生交叉免疫反应，实际测得结果为CsA及代谢物之和[8]。CsA在肝脏和小肠中由细胞色素P450 3A代谢，其代谢产物有30多种，代谢物是否具有CsA免疫抑制作用或毒性仍不明确，在试管中分离的CsA代谢物最多有10%～20%CsA母体化合物的活性，代谢物结合体具有增效和协同作用[9－10]。LC－MS/MS法测定结果为 CsA 原型药物浓度，能更准确地说明药物浓度－疗效－不良反应三者之间的关系[11]。本研究拟以TDx监测方法为参比，对CsA全血样本进行LCMS/MS分析，考察两种方法的相关性，为LCMS/MS法测定CsA全血浓度的临床应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 仪器与试药

3200QTrap型液相色谱－串联质谱仪：美国Applied Biosystems公司产品，配有电喷雾离子化源（ESI）以及 Analyst 1.4.2数据处理软件；Agilent 1100高效液相色谱系统：美国Agilent公司产品，包括四元输液泵、自动进样器、切换阀；电子天平（CP225D）；TDx快速血药浓度测定仪：美国Abbott公司产品。

TDx全血环孢素试剂盒：美国Abbott公司产品；96孔MAS蛋白沉淀板：天津博纳艾杰尔科技有限公司产品；CsA对照品（纯度为98.8%，批号：0495－200202）：由中国药品生物制品检定所提供；CsD对照品（纯度为95.0%，批号：09120731）：由上海同田生物技术有限公司提供；甲醇，乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；受试者给药后收集的全血样本和空白人全血由第二炮兵总医院提供。

1.2 LC－MS/MS分析方法

1.2.1 色谱条件 Kromasil－C18色谱柱（20mm×4.6mm×5μm）；流动相：甲醇－1mmol/L乙酸铵溶液；梯度洗脱，流速1.0mL/min；柱温65℃；进样量10μL。

1.2.2 质谱条件 离子喷雾离子化源，正离子方式检测；离子喷射电压5 500V；温度580℃；源内气体1（GS1，N2）压力55psi，气体2（GS2，N2）压力60psi；气帘气体（N2）压力20psi；碰撞气体（N2）压力：Medium；扫描方式：多反应监测（MRM）；CsA、CsD解簇电压（DP）分别为110、110eV，碰撞能量（CE）分别为55、90eV；CsA、CsD用于定量分析的离子反应分别为m/z 1 202.4→675.6和 m/z 1 216.9→199.2；CsA用于定性分析的离子反应为 m/z 1 219.9→1 202.9。

1.2.3 溶液的配制 对照品储备液的配制：精密称取10.0mg CsA对照品，置于10.0mL量瓶中，加入甲醇溶解，并稀释至刻度，配制成1.0 g/L CsA储备液。标准母液的配制：取10μL CsA储备液，置于10mL量瓶中，加入空白全血溶解，并用空白全血稀释至刻度，配制成1.0 mg/L CsA母液。标准曲线样本的配制：分别取CsA母液适量，用空白全血稀释至标准曲线所需浓度的全血溶液，浓度分别为10.0、30.0、100.0、300.0、1 000.0、1 500.0μg/L。分别取CsA母液适量，用空白全血稀释至质控样本所需浓度的全血溶液，分别为30.0、300.0、1 200.0 μg/L。内标溶液的配制：精密称取10.0mg CsD对照品，置于10.0mL量瓶中，加入甲醇溶解，并稀释至刻度，配制成1.0g/L储备液；精密量取5μL上述CsD储备液，置于50mL量瓶中，加入甲醇溶解，并稀释至刻度，即为100μg/L CsD溶液。红细胞破碎剂的配制：精密称取14.38g ZnSO4·7H2O，置于500mL量瓶中，加入蒸馏水溶解，并稀释至刻度，即为100 mmol/L硫酸锌溶液。

1.2.4 全血样品处理 精密取50μL全血样本，置于1.5mL EP管中，加入50μL红细胞破碎剂，200μL内标CsD溶液，涡旋2min，以13 200r/min离心5min，取上清液，进样20μL，进行LC－MS/MS分析。

1.2.5 MAS蛋白沉淀板法 将蛋白沉淀板的每孔加入2mL乙腈活化，负压抽干，加入100 μL经前处理后的全血样品，100μL乙腈沉淀剂，涡旋3min，加负压，收集上清液于接收板中，取上清液，进样20μL，进行 LC－MS/MS分析。

1.3 TDx分析法

取150μL全血样本，加50μL专用红细胞破碎剂，混匀，再加入300μL蛋白沉淀剂，混匀，离心5min，取150μL上清液，置于TDx仪测定。

1.4 统计学处理

数据以“均数±标准偏差”表示，运用SPSS统计软件中pearson方法进行相关性的统计。通过计算“（LC－MS/MS法测定浓度/TDx分析法测定浓度）×100%”的值来描述两种方法之间的关系，并且进一步探讨治疗窗。

2 结果

2.1 LC－MS/MS法和TDx分析法测定全血中环孢素A浓度

将27例CsA患者全血样品经前处理后，分别采用LC－MS/MS法和TDx法进行浓度测定，LC－MS/MS法平行测定6次，TDX法测定1次，测试结果示于图1。可见LC－MS/MS法测定CsA血药浓度平均值为（99.9±62.7）μg/L，小于TDx法测定的浓度平均值（199.7±129.1）μg/L；两种测试方法测定结果相关系数r平均为0.929，远大于不相关临界值，证明两种方法线性相关；LC－MS/MS法与TDx法测试受试者全血样品浓度比值为（51.6±9.3）%。

2.2 MAS沉淀蛋白板与蛋白沉淀法测定环孢素A浓度

将同一批次19例全血样品分别用MAS沉淀蛋白板和蛋白沉淀法进行前处理，取两者上清液进行质谱检测，浓度变化示于图2。将两种测试方法比较，发现MAS沉淀蛋白板可以测得较高浓度，它能使细胞中的药物释放出来，并且样品处理更干净，浓度升高，且适合大批量样品的处理。

图1 LC－MS/MS法和TDX分析法测定全血中环孢素A浓度曲线图Fig.1 The diagram of curves of concentration by LC/MS－MS and TDX

图2 MAS沉淀蛋白板和蛋白沉淀法测定全血中环孢素A浓度曲线图Fig.2 The diagram of curves of concentration by Cleanert MAS and precipitation of protein

3 讨论

LC－MS/MS法测定的CsA血药浓度小于TDx法测定结果，因为TDx实际测得结果为环孢素及其代谢物之和，LC－MS/MS法测定结果为CsA原型药物浓度，从而能更好的反映体内药物浓度变化。本研究将LC－MS/MS法和TDx分析法的测试结果进行相关性检验，相关性较好。LC－MS/MS法和TDx分析法自身配对比值平均值（51.6±9.3）%，可以根据此比值推测LC－MS/MS法适用于CsA血药浓度监测的治疗窗。

本研究将两种监测方法的测定结果进行比较分析，为评价方法和推广方法开创了新思路。TDx法简便、迅速，但需要特定的试剂盒，成本较高，测定结果偏高。LC－MS/MS法用血量少、分辨性能高、灵敏度高（10μg/L）、分析速度快、样品监测量大，对CsA的体内代谢产物不存在交叉免疫反应，更能反映药效。因此，LC－MS/MS法可成为免疫抑制剂临床血药浓度监测的常规方法。

环孢素A主要分布在全血中，血浆药物浓度远低于全血药物浓度，因此，本研究选用全血作为分析测试对象。采用 LC－MS/MS法和TDx分析法测定CsA血药浓度，在不影响灵敏度的前提下，全血样本均采用极其简便的沉淀蛋白法，节省了大量的前处理时间。在LC－MS/MS法试验中，选用环孢素D作为内标，与文献[12]所用环孢素D一致，通过优化柱温、洗脱梯度、流动相和内标加入量后，CsA和内标均得到较好的色谱峰。MAS沉淀蛋白板经过活化，加入血样后负压抽滤，即可完成前处理过程，具有较好的除磷脂效果，能更好的保护实验仪器，且平行性良好，是一种高通量的样品处理方法。

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