液相色谱－串联质谱法测定养殖鱼中痕量安眠酮的残留量

于慧娟，沈康俊，李向军，惠芸华，金高娃，黄冬梅，苏 惠

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；2.上海海洋大学，上海 200090；3.大连海洋大学，辽宁 大连 116023）

安眠酮又称甲苯喹啉酮（methaqualone，C16H14N2O），白色结晶粉末，无臭、微苦，熔点120℃，微溶于水，易溶于乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等，具有吸湿、镇静和催眠的作用。安眠酮系喹唑酮类衍生物，临床上常用作催眠药、镇定药，主要用于动物过度兴奋或惊厥，可使机体平静；但该药副作用较大，进入人体后，会表现出恶心、呕吐、头晕、无力、四肢及口舌麻木，个别较重患者会有短时间的精神失常，过量服用可出现昏迷、心跳过速、呼吸抑制等症状；如果长期摄入，人体可产生耐药性。近年来，随着养殖业的迅速发展，一些不法分子在经济利益的驱动下，置法律法规于不顾，为达到保活、保重以及增加捕获量的目的，在鱼类产品运输和捕捞过程中擅自在饲料中非法添加安眠酮，导致该药物在产品中的残留，给食品安全带来严重隐患。为严格控制安眠酮被非法使用，农业部在235号公告中将安眠酮规定为“禁止使用的药物，在动物性食品中不得检出”[1]。

目前安眠酮的检测方法主要有薄层色谱法[2－3]、气相色谱－质谱联用法[4]、光谱法[5]、液相色谱法[6－8]和超高压 液质联 用法等[9]，这些方法主要用于人体血浆、头发及猪肉、猪肾和饲料中安眠酮的测定，而关于水产品中安眠酮的残留检测却鲜有报道。本研究采用高效液相色谱－串联质谱技术开发鱼组织中痕量安眠酮的残留检测方法，探讨样品前处理方法，并对方法的有效性进行评价，为水产行业安眠酮残留检测标准的制定提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

TSQ Quantumn Acesses高效液相色谱－四极杆串联质谱联用仪：美国Thermo－Fisher公司产品；3510超声波清洗器；固相萃取装置，Organomation氮吹仪：美国Supelco公司产品；TDL－60B离心机：上海安亭科学仪器厂产品。

1.2 主要试剂与材料

安眠酮（MTQ，1g/L甲醇溶液）、安眠酮同位素标记物（MTQ－D7，1g/L 甲醇溶液）：购自美国剑桥公司；甲醇、甲酸、正己烷、乙醚和丙酮（色谱纯）：购自美国Fisher公司；实验用水为Milli－Q超纯水；硅胶柱（3mL/500mg）：美国Supelco公司产品；样品为均质后的草鱼、鲈鱼和鳗鲡鱼糜。

1.3 工作液的配制

1.3.1 标准工作液的配制 采用逐级稀释法用V（甲醇）∶V（水）＝1∶1的溶液将安眠酮配制成浓度分别为0.1、0.5、2.0、10、25和100μg/L系列标准工作溶液，此工作液中均含有2μg/L MTQ－D7。

1.3.2 内标工作液的配制 采用逐级稀释法用甲醇将安眠酮同位素标记物溶液配制成浓度为50μg/L的工作液。

1.4 样品前处理

称取5.00g（精确到0.05g）已均质好的样品于50mL离心管中，加入100μL内标工作液，放置30min，使内标物完全渗透，然后加入3 mL水和15mL正己烷，用玻璃棒搅拌，分散均匀，超声提取10min，震荡提取3min以4 000 r/min离心10min，转移上层清液至25mL容量瓶中；残渣中再加入10mL正己烷，按上述方法重复提取1次，合并提取液，用正己烷定容至25 mL。取10mL提取液加入预先用5mL丙酮和5mL正己烷活化好的硅胶柱中，用10mL 25%的乙醚－正己烷混合液淋洗，弃去淋洗液；用8 mL 50%的乙醚－正己烷混合液洗脱，收集洗脱液于离心管中，吹氮浓缩至干。准确加入1mL V（甲醇）∶V（水）＝1∶1的溶液溶解残留物，经0.22μm水相滤膜过滤后，供高效液相色谱－串联质谱测定。

1.5 液相色谱－质谱条件

1.5.1 液相色谱条件 色谱柱：Capcell PAK MGⅡC18柱（100mm×2.1mm×3.0μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）；梯度洗脱程序：0～1min、50%B，1～1.1min、50%～95%B，1.1～8min、95%B；流速0.3mL/min；柱温25℃；进样量20μL。

1.5.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），正离子多反应监测（MRM）模式，喷雾电压4 500V，离子传输毛细管温度350℃，源内碰撞诱导解离电压10V，鞘气流速11.0L/h，辅助气流速为6.0L/h。多反应监测离子对和碰撞能量列于表1。

表1 安眠酮的监测离子对和碰撞能量Table 1 Optimized multiple reaction monitoring parameters and collision energy for methaqualone

2 结果与讨论

2.1 离子源条件的优化及安眠酮定性、定量信息的确定

将浓度为1mg/L安眠酮标准溶液以蠕动泵进样方式注入质谱仪中，在m/z 150～500扫描范围内以正离子模式对其进行一级质谱全扫描，以确定安眠酮分子的[M＋1]＋峰；以分子离子峰为母离子，对离子源参数（喷雾电压、鞘气、辅助气、源内碰撞诱导解离电压）进行优化，使质谱仪的测定灵敏度达到最高；然后在一定的碰撞能量下对安眠酮的子离子进行全扫描，以确定安眠酮的主要离子碎片，二级质谱扫描图示于图1。由图1可以看出，安眠酮可产生3个主要碎片离子，分别为m/z 91.19、117.16和132.17，结合样品空白基质的质谱图选取离子丰度最高、本底干扰最小的m/z 251.1/91.19为定量离子对，m/z 251.1/132.17和 m/z 251.1/117.1为定性离子对。

2.2 样品前处理方法的研究

2.2.1 提取剂及提取方式的优化 为了使水产品中残留的安眠酮提取效果达到最高，综合安眠酮的性质，分别采用正己烷和乙腈为提取剂进行提取实验，通过比较回收率大小来评价提取剂的提取效果。具体方法为：分别在5g草鱼阴性样品中加入100ng安眠酮标准品，不加内标物，然后用乙腈和正己烷分别进行提取，经浓缩、净化后，按1.5.1条件进行分析，通过比较回收率的大小来评价提取剂的提取效率。实验结果表明：正己烷的提取效率为85%，而乙腈的提取效率为93%。虽然乙腈的提取效率大于正己烷，但用乙腈作提取剂时，乙腈需蒸干，且在蒸干过程中因提取液中含有少量的水，易产生爆沸现象，使蒸发浓缩过程难以控制，后处理麻烦；而用正己烷作提取剂，提取液可直接用硅胶柱进行净化，操作简便容易控制，所以将正己烷确定为最佳提取剂。

由于水产品的水分较高，使样品在正己烷中分散不好，故本实验选择先加入3mL水使鱼类样品在水中分散后，再用正己烷提取的样品前处理方法。

图1 安眠酮的子离子扫描图Fig.1 Product ion scans spectra for methaqualone

2.2.2 硅胶柱对安眠酮吸附性能的研究及洗脱剂配比的优化 样品用正己烷提取后，提取液中含有大量的脂溶性杂质，这些杂质如不去除，将会污染色谱柱和离子源，影响安眠酮的定性与定量。安眠酮属于脂溶性物质，较易溶于正己烷，所以不能采用常规的正己烷液－液萃取净化方法。本实验使用极性硅胶柱净化，通过分析上样流出液中安眠酮的浓度，确定硅胶柱是否能够吸附安眠酮。具体实验方法为：选用规格为3mL/500mg极性硅胶柱；将阴性的草鱼和鲈鱼样品用25mL正己烷提取2次，提取液经离心合并后，加入250ng安眠酮；取10mL提取液用硅胶柱净化，接收上样流出液，取5mL流出液用氮气吹干，然后用1mL V（甲醇）∶V（水）＝1∶1的溶液溶解，上机分析，看上样流出液中是否有安眠酮被检出。实验结果表明，草鱼和鲈鱼上样流出液中没用安眠酮的存在，所以可以认为硅胶柱对安眠酮有良好的吸附性能，适用于提取液中安眠酮的富集。

将吸附有安眠酮的硅胶柱分别用8mL 25%、35%、40%、50%的乙醚－正己烷混合溶液进行洗脱，洗脱液经氮气吹干后，用1mL V（甲醇）∶V（水）＝1∶1的溶液溶解，上机测定，通过比较回收率的大小来寻找最佳洗脱剂配比，实验结果列于表2。可以看出，随着洗脱剂中乙醚比例的增加，安眠酮的回收率从0上升至95%以上，所以最佳洗脱剂为V（乙醚）∶V（正己烷）＝1∶1的洗脱液。

表2 不同洗脱剂条件下安眠酮的回收率Table 2 Recoveries of methaqualone in different eluting agent

2.3 方法有效性评价

2.3.1 选择性评价 按照1.4和1.5处理鳗鲡、鲈鱼、草鱼的空白样品和加标样品，通过分析空白样品和加标样品色谱峰的出峰情况，考察方法的选择性。样品空白谱图及加标谱图示于图2～5。图2～4为3种空白样品谱图，图5为定量限下鳗鲡加标谱图。经空白样品与加标样品谱图对比分析可以看出，3种空白样品在安眠酮出峰处基质干扰很小，样品中安眠酮的定性与定量准确，所以该分析方法选择性高。

2.3.2 准确度和精密度 分别以阴性的草鱼、鲈鱼和鳗鲡为测试对象，进行加标回收率和精密度实验，通过标准添加实验考察方法的准确度、重现性及对不同种类鱼的适用性。实验按1.4和1.5进行，安眠酮的添加水平分别为0.2、0.5、1.0和20μg/kg，每个加标水平做5个平行实验，每个水平重复5次加标，批内和批间测定结果列于表3和表4。

图2 鲈鱼空白样品多反应监测色谱图Fig.2 Chromatograms of Japanese sea bass blank sample by MRM mode

图3 鳗鲡空白样品多反应监测色谱图Fig.3 Chromatograms of marbled eel blank sample by MRM mode

由表3和表4可知，3种受测水产样品的实际加标回收率均大于80%，信噪比≥10，精密度小于15%，方法的准确度和精密度均能满足药残检测的要求，由此证明该方法适用于不同种类鱼类样品中安眠酮残留的测定。

图4 草鱼空白样品多反应监测色谱图Fig.4 Chromatograms of grass carp blank sample by MRM mode

图5 鳗鲡加标样品多反应监测色谱图（0.2μg/kg）Fig.5 Chromatograms of marbled eel blank sample spiked with methaqualone by MRM mode（0.2μg/kg）

表3 鱼肌肉中安眠酮批内回收率和精密度（n＝5）Table 3 The intra－batch recovery and RSD of methaqualone in fish

表4 鱼肌肉中安眠酮批间回收率和精密度（n＝5）Table 4 The inter－batch recovery and RSD of methaqualone in fish

2.3.3 检出限、定量限及线性范围 为确定方法的定性检出限和定量限，分别处理草鱼、鳜鱼和鳗鲡空白样品，考察空白样品的背景值，确定方法的定性检出限为0.05μg/kg（S/N≥3），定量限为0.20μg/kg（S/N≥10），定量限下批内和批间测定结果列于表3和表4。

将安眠酮配制成不同浓度的标准溶液，上机分析，以安眠酮与安眠酮同位素标记物（MTQD7）的峰面积比为纵坐标，安眠酮浓度为横坐标进行线性回归分析。由实验结果可知，安眠酮在1～100μg/L浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数R2大于0.998 2，回归方程为y＝0.225 67x＋0.000 677 6。

2.4 方法应用

应用液相色谱－串联质谱法分别对上海农贸市场的鳗鱼、鲈鱼、鳜鱼和大黄鱼等鱼类样品进行检测，结果表明，该方法简单、灵敏度高、适用性强，适用于鱼类样品中痕量安眠酮残留量的测定。

[1]中华人民共和国农业部公告，第235号.

[2]员克明，李贵明，王英元，等.安眠酮薄层色谱扫描检测研究[J].中国法医学杂志，1997，12（1）：25－27.

[3]BUDD R D，YANG F C，LEUNG W J.Mass screening and confirmation of methaqualone and its metabolites in urine by radiommunoassary－thinlayer chromatography[J].J Chromatogr，1980，190（1）：129－132.

[4]孙红雷，李文海.血中安眠药物的固相萃取GC/MS分析方法研究[J].分析测试技术与仪器，2008，14（4）：209－213.

[5]吴玉红，谭家镒，朱桂生.血中安眠酮的硅藻土提取紫外导数光谱测定法[J].中国法医学杂志，1996，11（4）：229－233.

[6]郭幼梅，诸秋珉，姜 宴.用HPLC法同时检测生物检材中安眠酮及其2－羟甲基代谢物[J].上海医科大学学报，1996，23（1）：43－45.

[7]中华人民共和国农业部.NY/T 1463—2007饲料中安眠酮的测定 高效液相色谱法[S].北京：农业出版社，2007.

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[9]孙 雷，张 骊，徐 倩，等.超高效液相色谱－串联质谱法检测猪肉和猪肾中残留的10种镇静剂类药物[J].色谱，2010，28（1）：38－42.