联合用药对胃癌细胞生长的抑制作用

张 利 姚俊芳 吴慧丽



联合用药对胃癌细胞生长的抑制作用

张 利 姚俊芳 吴慧丽

（河南省郑州市中心医院消化一科，郑州 450007）

研究雷帕霉素联合阿霉素对胃癌细胞（BGC-823）增殖抑制及凋亡的影响，并探讨机制。细胞培养，通过甲基噻唑基四唑（MTT）法检测雷帕霉素（RAPA）干预组、阿霉素干预组及联合干预组对胃癌细胞系增殖抑制作用；流式细胞仪法分别检测各组细胞周期及凋亡率；western试验检测抑癌基因p53、APC、DPC4蛋白表达水平。RAPA能抑制胃癌细胞的增殖，其促凋亡作用最弱；单独应用阿霉素及阿霉素联合20.0nmol/L RAPA均可显著抑制胃癌细胞的增殖，且联合应用抑制率显著升高（＜0.01）；流式细胞仪检测显示阿霉素及联合应用均可增加胃癌细胞的凋亡率（＜0.01）；western试验提示联合应用组p53、APC、DPC4蛋白表达水平升高。RAPA能抑制胃癌生长，mTOR信号通路参与调控胃癌细胞的增殖与凋亡，mTOR信号通路抑制剂RAPA可提高抑癌基因p53、APC、DPC4蛋白表达、增强阿霉素的抗肿瘤效应。

胃癌；雷帕霉素靶蛋白；信号通路；雷帕霉素；阿霉素；中医病因

目前肿瘤治疗热点在分子水平，mTOR信号通路与肿瘤发展和转移有关，作为Akt下游的重要底物之一，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以整合氨基酸、能量、生长因子所激发的信号通路，借以调控细胞生长增殖和细胞周期，通过控制其下游与翻译、转录有关的多种蛋白的磷酸化来发挥其生物学作用，在细胞的生存、生长和增殖中起中心调控作用，其转导的信号通路的异常与多种肿瘤的形成密切相关，是肿瘤理想的治疗靶点之一[1]。本研究为阿霉素及其联合mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素，对体外培养的胃癌细胞株的杀伤和抑制作用及检测抑癌基因p53、APC、DPC4蛋白表达，并探讨其机制，以期为寻找新的化疗方案提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 doxorubicin，噻唑蓝（MTT），二甲亚砜（DMSO），胎牛血清，RPMI-1640，碘化丙啶（PI），96孔培养板，酶联检测仪，流式细胞仪，CO2孵箱，细胞计数板，雷帕霉素，细胞裂解液（晶美生物），western-bloting试剂盒，p53、APC、DPC4兔抗人一抗，羊抗兔二抗，Ecl试剂盒（Santa公司）5*上样baffer，电泳和电转槽，底片、显影液和定影液。

1.2 细胞株和细胞培养 ①细胞株：人胃癌细胞株BGC-823（中国科学院上海细胞生物研究所细胞库）；②细胞培养：将胃癌细胞在培养箱中进行单层传代培养，2d更换培养基1次，1∶4常规传代培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 MTT毒性实验 细胞96孔培养板贴壁后，实验组换成单用doxorubicin、雷帕霉素及它们的混合液，对照组加等量相同不含药物培养液。药物作用24h后，于每孔中加入配制的0.5% MTT 20μl继续培养4h，弃上清，加入150μl DMSO，在混合振荡仪上振荡15min，使结晶物充分溶解后，于酶联检测仪上570nmol波长，测定各孔吸光光度值。计算细胞毒性值（CT%），CT%=（1-OD处理/OD对照）×100%。分别实验5次，结果以平均值±标均差表示。

1.4 流式细胞仪 检测doxorubicin、雷帕霉素及它们的混合液对BGC-823细胞周期和凋亡的影响：取中效浓度雷帕霉素（20nmol/l）、单加阿霉素（Dox，0.3µmol/l）组及联合组，于药物作用24h后，分别对各样本进行细胞周期分析，并计算凋亡率。

1.5 Western-blot检测p53、APC、DPC4蛋白表达 取对数生长期肿瘤细胞先加无血清培养液24h后，再按以上分组后分别加药，收集细胞，加裂解液提取总蛋白，通过Western-blot检测p53、APC、DPC4蛋白表达，测定积分灰度值，将p53、APC、DPC4/β-actin的比值作为蛋白表达的相对量。

1.6 统计学分析 数据以mean±SD表示，采用SPSS 13.0软件，单纯比较处理组与对照组之间的差别用Independend-Samples t Test。随机区组间三者或以上计量资料的两两比较，用Fisher LSD检验。

2 结果

2.1 MTT法测定细胞生存率 各实验组和对照组，药物作用24h后，分别对各组吸光值和细胞抑制率进行检测，并列表统计学分析，结果显示：3组均有肿瘤细胞抑制作用，以阿霉素较为明显，且联合作用抑制作用最为显著。

2.2 细胞周期和凋亡的检测结果 3组与对照组在各期、增殖指数和早期凋亡率上的比较，均有显著差异，而阿霉素单用组与对照组比较，各期细胞比例、PI和早期凋亡率的比较无统计学意义，显示雷帕霉素及其联合应用组药物作用肿瘤细胞后，与对照组比较细胞处于G0–G1期的比例增多，说明药物作用后细胞G1期延长和不增殖细胞群即G1期细胞增多，G1期延长意味着细胞增殖周期延长，增殖缓慢，而相对增殖期细胞减少，以联合组最显著；并分析含RAPA组的S期细胞比例可见，该期细胞明显减少，在联合组中更为突出。

2.3 western-blot对不同分组处理的胃癌细胞p53、APC、DPC4蛋白的检测 对照组及处理组药物干预肿瘤细胞24h后，裂解细胞行免疫印迹p53、APC、DPC4蛋白表达检测，各灰带值分别与β-actin进行效正。3组p53、APC、DPC4蛋白表达，阿霉素无明显差异，雷帕霉素组较为明显，且联合以上表达明显增强。

3 讨论

胃癌属中医反胃、噎嗝、胃脘痛、瘕、积聚等病证范畴。对于胃癌的成因，目前的认识主要有3个方面，一为正虚致病说，二为热毒致病说，三为痰凝血瘀说[2]。另外，气血瘀结、精神因素、脾胃失调、饮食不节等也是常见的致病因素[3]。

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol3-kinase，以下简称PI3K）信息传导通路的激活已被认为是肿瘤细胞抗凋亡的主要机制之一[4]。Akt[5]是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。该激酶可调节对生长因子、细胞因子和癌基因Ras起反应的细胞生存信号。PI3K和其它上游激酶参与Akt的激活[6]。

目前，我们公认的一些抑癌基因其中很多，主要与消化道肿瘤相关的有：p53、APC、DPC4，其中p53在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变。由这种基因编码的蛋白质是一种转录因子，其控制着细胞周期的启动。许多有关细胞健康的信号向p53蛋白发送。关于是否开始细胞分裂就由这个细胞决定。如果这个细胞受损，又不能得到修复，则p53蛋白将参与启动过程，使这个细胞在细胞凋亡中死去；APC基因是由Herrera于1986年对1例格德纳综合征（葡萄糖注射液）患者进行细胞遗传学研究时发现的一个新的抑癌基因，APC基因突变将导致其编码的APC蛋白的改变，产生截短的无活性的APC蛋白，截短APC蛋白可以通过与野生型APC基因产物结合而产生一种负显性作用，使其不能正常地发挥生理功能，导致细胞粘附、生长、分化、增殖、凋亡调控和细胞内信号等方面的重要改变，使细胞发生癌变，DPC4是新发现的抑癌基因，在消化道肿瘤，特别是胰腺癌中，约一半存在DPC4的缺失，DPC4基因参与TGF-β细胞内信号传导，是信号传递蛋白SMADs的功能中心。TGF-β的生物学效应都是Smad4与通路中不同蛋白连接作用的结果。

作为Akt下游的重要底物之一，mTOR是一种跟PI3K/Akt通路相关的蛋白激酶，能通过磷酸化激活与mRNA翻译相关的蛋白p70S6K等来增强mRNA的转录和翻译，也能通过磷酸化灭活翻译抑制蛋白4EBP1等。Akt通过磷酸化mTOR的Ser2448位点而激活mTOR，提高mRNA翻译的效率，从而增加一系列与细胞生长和分化相关蛋白的表达，加快了肿瘤的发生。Akt/mTOR通道有：①抑制细胞凋亡，促进细胞生存；②促进细胞周期运行；③提高血管内皮因子表达，促进血管形成；④促进恶性肿瘤细胞的侵袭和转移等。

进展期肿瘤的治疗问题，主要是手术切除和解决肿瘤细胞的无限增殖，而对细胞调控点的抑制作用是解决细胞增殖的关键，细胞周期的调控点有3个：G1期控制点，S期及M期控制点。此次试验结果提示，RAPA可调控胃癌细胞生长周期，作用点主要是对G1期控制点，联合阿霉素可明显抑制胃癌细胞增殖，并可以增加阿霉素细胞毒性效果，细胞凋亡明显增强。结合western-blot检测结果，我们可以推出，通过抑制雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通道，直接或间接增强了一些抑癌基因如p53、APC、DPC4的表达，从而调控细胞凋亡。雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通道可通过调控抑癌基因，参与胃癌细胞的增殖与凋亡，雷帕霉素可增强阿霉素的抗肿瘤效应。

[1] Lang SA, Gaumann A, KoehlGE, et al. Mammalian target of rapamycin is activated in hum an gastric cancer and serves as a target for therapy in an experim entalm odel[J]. Int J Cancer,2007,120(8):1803-1810.

[2] 刘成林,刘丽萍.胃癌的中医及中西医结合治疗进展[J].山东中医学院学报,1994,18(3):209.

[3] 刘友章,于向民.胃癌的中医药临床研究进展[J].新中医,1996,28(12):51.

[4] Cantley LC. The phosphoinositide 3-kinase pathway[J]. Science, 2002,296 (5573):1655-1657.

[5] Nicholson KM, Anderson NG. The protein kinase B/Akt signalling pathway in human malignancy[J]. Cell Signal,2002,14:381-395.

[6] Garg A, Aggarwal BB. Nuclear transcription factor-kappaB as a target for cancer drug development[J]. Leukemia,2002,16(6):1053-68.

（本文校对：苏玲 收稿日期：2012-02-05）

10.3969/j.issn.1672-2779.2012.06.076

1672-2779（2012）-06-0116-02