普通白菜遗传转化研究进展

陈泠先 崔丽洁 钱忠英 潘静娴 开国银

（上海师范大学植物种质资源研发中心生命与环境科学学院，上海 200234）

普通白菜（小白菜）〔Brassica campestrisL. ssp.chinensis（L.）Makino var.communisTsen et Lee〕属十字花科芸薹属，是我国长江流域及南方各省普遍栽培的重要绿叶蔬菜之一，在蔬菜的周年生产、缓解淡季供应中具有重要作用。但在普通白菜的生产中，迫切需要培育抗病、抗虫、抗逆和具有优良农艺性状的新品种。随着组织培养和DNA重组技术的建立和不断完善，转基因技术已经成为改良作物农艺性状的重要手段（罗静 等，2007）。目前，通过遗传转化技术来改良普通白菜的某些特性，如抗虫性、抗病性、耐热性，已经成为比较热门的研究方向。本文对普通白菜的再生体系、遗传转化方法和外源基因表达等研究进展进行了概述。

1 普通白菜再生体系

较之其他芸薹属植物，普通白菜的植株再生较为困难，这严重制约了其遗传转化的效率，因此，植株的高频再生体系的建立成为重要的研究基础。影响再生的因素很多，如外植体的基因型、类型、生理状态及培养基成分等。

1.1 外植体

外植体的基因型不同，再生能力也不同。张凤兰等（2002）在对普通白菜再生体系的研究中证明了不同品种的再生能力差异显著，再生频率为 6.7%～97.5%。曹家树等（2000）研究了上海青、矮抗青、杭州油冬儿等 6个普通白菜品种的离体培养植株的再生频率，发现青梗类品种的植株再生频率明显高于白梗类品种，从而认为青梗类品种更适宜离体培养。Memon等（2009）选取了 6个普通白菜栽培种进行再生研究，发现不同品种间不定芽再生率明显不同，其中柳川大缩缅再生率最高。可见，基因型对植株再生频率的影响很大，基因型的选择对普通白菜的遗传转化尤为重要。

不同类型外植体的再生频率也有很大差别。蔡小宁等（1997）研究转化了普通白菜的子叶、子叶柄和真叶，其再生频率有显著差异，矮脚黄的子叶、子叶柄、真叶的再生频率分别为15.8%、6.1%和2.7%，子叶的再生频率较高；陈敏敏和侯喜林（2008）研究表明，不同品种的普通白菜中，暑绿的带柄子叶再生频率高达 80%；而在吕艳艳等（2010）的报道中，下胚轴的再生频率几乎为 0，子叶柄产生不定芽的再生频率达 59%，而以子叶作为外植体时，不定芽的再生频率仅为 23%。带柄子叶具有较高的再生频率，可能是因为子叶—子叶柄带有部分分化能力较强的原分生细胞，还可以得到来自子叶块的营养（主要是内源激素），且子叶柄切面上的薄壁细胞具有广泛的分裂活性，易受到农杆菌侵染，而其他类型的外植体没有带柄子叶有优势。

外植体的苗龄对再生频率也有很大影响。苗龄过大、过小对不定芽的形成均不利。谢建坤等（2000）报道5～9 d苗龄的外植体可以获得较高的不定芽再生频率；高红亮等（2008）的试验结果表明4～7 d苗龄的外植体再生效果较好，其中二青以4 d苗龄为最好，不定芽分化率高达76.5%，而常州乌塌菜6 d苗龄时不定芽分化率达94.1%；但张智奇等（1998）、Zhang等（1998）的报道中，都以4 d苗龄的带柄子叶为最佳外植体。一般地，4～7 d苗龄时外植体的再生能力较高，如果苗龄过大，子叶柄切面上的细胞难以脱分化，细胞的分裂能力会降低，从而降低外植体的再生能力。

1.2 培养基

在植物的再生培养体系中，培养基及其成分也起着重要作用。培养基的琼脂浓度影响再生频率。Zhang等（1998）用不同琼脂浓度的培养基处理外植体，发现琼脂浓度为1.2%或1.6%的培养基比 0.8%的培养基芽再生率高 2～3倍，并且随着琼脂浓度的升高，培养基中的乙烯含量逐渐降低。这可能是高浓度的琼脂含量影响培养基中水分的存在状态，同时培养基中湿度下降，改变了离体再生的微环境而使再生频率得以提高。

培养基中的激素种类及其配比是影响外植体分化最关键的因素之一。在徐淑平等（2002）的试验中，以2 ip 7.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1的配比最有利于普通白菜矮抗青下胚轴和子叶不定芽的分化，前者最高芽分化频率达48%，后者达42%。而苏军等（2002）的研究表明，培养无菌苗时添加植物激素，特别是较高浓度的6-BA与NAA组合，对外植体的脱分化和不定芽的再生具有积极意义。

培养基中加入AgNO3可明显提高转化效率。培养基中添加AgNO3后，Ag+竞争性结合位于细胞间膜的乙烯受体部位而抑制乙烯活性，并且干扰乙烯信号传递途径，从而促进器官发生和体细胞胚胎发生。秦新民等（1997）研究表明，在含4 mg·L-1AgNO3的培养基上，鸡毛菜、矮脚黄的不定芽分化率分别由原来的23.3%、36.7%提高到41.3%、61.3%；四月慢和白雪小白菜则在6 mg·L-1AgNO3时不定芽的分化率最高，分别是43.7%和53.8%。也有学者认为AgNO3与ABA配合使用更能促进不定芽的发生，如王火旭等（2001）认为AgNO3与ABA具有协同增效作用，其中AgNO3是关键因子，ABA有促进作用，能改善不定芽的质量，减少玻璃芽的产生。但对某些基因型品种，添加AgNO3并没有使其诱导出不定芽（Zhang et al.，1998），而且随着AgNO3含量的提高，芽分化率有所降低，这可能是由于Ag+与培养基中的阴离子发生反应，打破了离子平衡，改变了培养基的pH值。而且Ag+离子是重金属，对植物体有毒害作用，因此培养基中AgNO3的含量不能过高（杜虹 等，2000）。

2 普通白菜转基因方法

培养抗病、抗虫、抗逆的普通白菜新品种一直是生产上亟待解决的难题。近年来发展起来的基因工程转化技术为这一难题提供了新的解决途径。基因工程是在重组DNA技术上发展起来的一门新技术，即将外源目的基因经过或不经过修改，通过生物、物理或化学的方法导入植物体进行重组，以改良植物体的性状，得到优质、高产、抗病虫及抗逆性强的新品种。

植物基因转化方法主要有农杆菌介导法、PEG法、电融合法、基因枪法、显微注射法、激光束穿刺法、脂质体法、转化丝法等，在普通白菜上目前使用的主要是农杆菌介导法和电融合法。

2.1 农杆菌介导法

农杆菌介导法是迄今植物基因工程中应用最多、最理想、最简单的方法，已获得的转基因植物中 80%来自农杆菌介导法（高丽 等，2010）。用于植物遗传转化的农杆菌有两种：根癌农杆菌（Marc et al.，1989）和发根农杆菌（Christey et al.，1997），其中根癌农杆菌应用较为广泛。一般是取5～6 d苗龄的外植体预培养2 d后放入农杆菌中侵染，然后将外植体转移到培养基上共培养2 d，再将其转移到含有抗生素和抑菌素的选择分化培养基上，待长出苗后将其转移到生根培养基上，使其再生为植株。余小林等（2005）用农杆菌菌株EHA105和LBA4404感染普通白菜和菜薹（菜心）的子叶柄和子叶外植体，得出在进行白菜类作物遗传转化时LBA4404感染效果较好；而范正琪（2002）用EHA105和LBA4404侵染普通白菜的结果显示，EHA105转化时gus瞬时表达频率（52.0%）高于LBA4404（47.1%）。这可能与供试材料的基因型有关。

农杆菌介导的再生植株转化效率不是很高，研究表明决定目的基因诱导的关键时期为共培养时期。注意共培养的几个关键步骤可以使目的基因高效表达，进而为后期的转化打下基础：① 避免共培养基中含酵母提取物，通常把农杆菌培养液离心，用MS液体培养基重悬农杆菌沉淀（Jun et al.，1995；张凤兰，2004）；② 共培养基中要含有较高浓度的糖，蔗糖含量应在30%以上（范正琪 等，2002；余小林 等，2005）；③ 培养基pH值介于5.0～5.6之间（Jun et al.，1995）；④ 共培养时的温度低于 28 ℃，一般置于 25 ℃暗处进行共培养（张凤兰，2004；余小林 等，2005）；⑤ 共培养时间通常以 2～3 d为好（张凤兰，2004；余小林 等，2005）。目前只有范正琪（2002）通过普通白菜带柄子叶进行转化，发现共培养5 d时转化的频率较高。

在农杆菌介导的转化过程中，为了抑制农杆菌的生长，需要在共培养以后加入抗生素。抗生素的抑菌效果直接影响转化效率。白菜类作物常用的抗生素有氨苄青霉素、羧苄青霉素、头孢霉素、淡紫青霉素等。在有效抑菌浓度范围内，氨苄青霉素质量浓度在500 mg·L-1以下时，对不定芽的再生有轻微的抑制作用，而羧苄青霉素则有促进作用（250～500 mg·L-1），头孢霉素对不定芽的再生有明显抑制作用，易引起外植体伤口褐化死亡，也许与白菜类作物对头孢霉素过于敏感有关（范正琪 等，2002）。张凤兰（2004）通过研究不同浓度的淡紫青霉素对大白菜子叶不定芽的影响，发现不定芽的再生几乎不受淡紫青霉素的影响。目前在白菜类作物的遗传转化中应用比较广泛的仍是羧苄青霉素。

2.2 电融合法

电融合法是在强电场作用下，使生物组织细胞发生可逆的透性变化，产生直径约为 30 nm的瞬时孔洞，促进DNA分子进入原生质体，从而实现目的基因的导入。电融合法使用的电压梯度和脉冲持续时间与原生质体的大小有关。电融合法也可与PEG法等结合起来，提高转化频率。电融合法具有 3个优点：一是不存在对细胞的毒害问题；二是融合效率高；三是融合技术操作简便。在袁天华等（1994）的研究中，应用了电融合法对烟草和普通白菜原生质体进行烟草花叶病毒TMV-RNA的导入试验；侯喜林等（2001）以普通白菜OuCMS 91H秋-100（不育系）和91H秋-21（保持系）为试材，研究了不同交流场强、交流频率、直流脉冲场强、直流幅宽及脉冲次数对非对称细胞融合效果的影响，进而探索出合适的电融合条件。

3 普通白菜外源基因表达

随着基因转化技术的不断进步，在普通白菜中已经成功转化的目的基因种类也越来越多。目前，导入普通白菜的基因按功能来分主要有抗病基因、抗虫基因、改良品质基因和雄性不育基因等。

3.1 抗病基因

病毒病是普通白菜最主要的病害之一，常给普通白菜生产造成严重损失。在植物抗病毒基因工程中，外壳蛋白（CP）基因策略是应用最广泛的一种方法。通过遗传转化将病毒外壳蛋白编码基因转入受体细胞中表达，这些病毒外壳蛋白在植物细胞中的积累，能够抑制侵染病毒的复制，从而减轻症状或推迟病毒发生的时间（杨瑞环 等，2001）。Jun等（1995）通过农杆菌介导法将引起普通白菜病毒病的烟草花叶病毒（TML-L）的CP基因转入普通白菜spring flavor中，获得6株转基因植株，其中5株将TMV-CP基因遗传到了下一代。为了获得广谱抗性，也有研究者将多价基因转入到普通白菜中去。陈敏敏（2007）将由AFP2、TAP、Metch和BuforinⅡ4个基因构成的融合基因InBING转入普通白菜苏州青，获得了较好的抗病毒病的效果。

3.2 抗虫基因

十字花科蔬菜是品种最多、栽培面积最大的一类蔬菜，其害虫的类别也最多，危害也最大（吴钜文，1997）。由于自然界缺乏抗虫种质资源，用常规育种方法开展普通白菜的抗虫育种工作难以奏效，转基因作为一种很有效的方法使抗虫育种有了很大进展。蔡小宁等（1997）将豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）基因导入普通白菜品种矮脚黄和苏州青，获得卡那霉素抗性苗；佘建明等（2000）将CpTI基因导入普通白菜，获得具有较高抗虫性的转基因单株；张智奇等（1999）将慈姑蛋白酶抑制剂（AP1）基因导入普通白菜浦东矮箕菜和矮抗青，转化植株对菜青虫的生长发育有一定的抑制作用；徐淑平等（2002）通过农杆菌介导的Bt杀虫基因以及CpTI基因转化普通白菜，分别获得了带Bt基因以及CpTI基因的转基因普通白菜纯合系植株。这些抗虫基因的成功转化为应用基因工程培育抗虫普通白菜新品种奠定了良好的基础。

3.3 品质改良基因

目前，品质改良已经成为选育普通白菜新品种的主要目标，一些有价值的外源基因的导入无疑是一条有效的途径，但是目前有关普通白菜品质改良基因工程的研究报道较少。薛万新（2001）将叶球发育相关基因BcpLH转入普通白菜上海黑叶四月慢，但是其并没有发生表型变化。也有研究者将药用基因转入普通白菜，期望获得药食兼用的品种。如胡小平等（2006）将芪合酶基因转入普通白菜，产生并积累了具有降血脂、降血压等多种保健功能的3，4′，5-三羟基芪，最终培育出了药食兼用的普通白菜新品种。

3.4 雄性不育基因

Zhang等（2008）利用反义技术将与花粉表达有关的聚半乳糖醛酸酶基因BcMF6转入普通白菜，结果发现转基因植株中只有50%的花粉能够萌发。

虽然在普通白菜上成功导入了较多的外源基因，但是对于这些基因的表达效率来说，大部分没有得到预期效果，而且不同外源基因的表达差异也很大，这些基因的差异性表达不仅受到不同强度启动子的调控，而且转录水平的抑制和转录后mRNA的积累也会造成基因沉默（Maike et al.，1997）。所以如何控制外源基因沉默并提高外源基因表达效率是当前转基因工作面临的重要任务。目前研究表明，构建含 MARs的表达载体、选择特异性或诱导性的启动子、建立位点特异的重组体系、利用引导肽定位外源基因的表达产物、利用线粒体和叶绿体的转化以及对目的基因的改造等方法均在一定程度上可以提高基因的表达效率。

4 问题与展望

多年来学者们通过努力，成功摸索出普通白菜不同基因型品种的遗传转化体系，但仍存在很多问题：① 转化效率低。目前报道的普通白菜的转基因植株所占比例较小，介于 0.35%～1.13%之间，遗传转化体系各项参数还有待优化，从而进一步提高转化率。② 不具有普遍性。目前普通白菜的遗传转化体系受植物基因型影响较大，个体差异较大，可操作性较差。③ 转基因检测手段不健全。目前所报道的普通白菜转基因检测大多数仅采用了PCR验证。实际上PCR检测的假阳性较高，仅依赖PCR检测不能真实的反应外源基因的整合情况，不能很好的检验遗传转化体系的可靠性。④ 遗传稳定性研究缺乏。普通白菜的转化植株后代遗传稳定性的问题还没有得到真正的解决，还需进一步深入研究。

目前有关普通白菜的分子生物学研究鲜见报道，基因工程研究进展缓慢。多数研究仍停留在基因克隆分析阶段。要充分利用基因图谱和分子标记等生物技术手段，使育种从依靠表现型选择向依靠基因型选择飞跃；针对普通白菜的重要病虫害，有重点地开展蔬菜病虫害分子生物学研究工作，寻找有效的抗病虫基因，为病虫害控制和抗病虫品种的培育奠定基础。

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