间充质干细胞与神经系统变性疾病研究进展

张 平 张本恕

(河北大学附属医院神经内科，河北 保定 071000)

神经变性疾病是一类缓慢起病，病程呈进行性发展，预后极差的疾病，迄今为止几乎没有任何有效的治疗方法。临床常见的神经变性疾病有帕金森病(PD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、亨廷顿舞蹈病(HD)、阿尔茨海默病(AD)等。这些疾病虽病因各不相同但在病理上均有不同部位及不同程度的神经元脱失和功能异常。尽管已证实成体的某些脑组织区域(如脑室下及海马齿状回)仍存在神经发生，甚至在人类也发现了这一现象，但中枢神经系统的自我修复能力仍然是十分有限的，原因是因为成体缺乏足够数量的内源性干细胞，而对于神经变性疾病，内源性干细胞更为缺乏，加之细胞构成环境的异常，使丢失的神经细胞无法得以修复。替代丢失的神经元，使之功能恢复，延缓病程进展，是治疗这类疾病的新思路。间充质干细胞(MSCs)是成体干细胞家族的重要成员，最近医学领域乃至整个生命科学领域的研究重点和前沿。

1 MSCs来源

MSCs源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，属于非终末分化细胞，它既有间质细胞，又有内皮细胞及上皮细胞的特征。起初认为MSCs仅存在于骨髓，然而近几年发现，MSCs还可来源于其他组织〔1～4〕，如脂肪组织、胎儿组织、羊水、骨膜。研究证实人体各个器官和组织都存在 MSCs〔5～8〕，并且从不同的动物猫、狗、狒狒、猪均可获得。MSCs的数量随着年龄增长〔6〕和身体虚弱〔7〕下降，新生儿的MSCs的量最多，然后到80岁时大约下降50%〔6〕。

临床上获得MSCs的方法最通常是从骨髓中分离，常用的骨髓MSCs分离与培养方法有贴壁培养筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪或免疫磁珠分选法。贴壁筛选法是根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，如造血系细胞、内皮细胞等，达到分离纯化干细胞的目的，此方法操作简单，对细胞损伤小。因此目前常用方法仍为贴壁法。

2 MSCs的生物学特性

2.1 MSCs具有多向分化特性 MSCs在上世纪60年代被发现后，它的多向分化能力就被人们所重视。目前相当多的实验已证实，在适当的条件下，MSCs可以分化为脂肪、成骨、软骨、骨骼肌、心肌、肌腱等中胚层来源的细胞，而且还可以横向分化〔9〕为外胚层，如神经细胞〔10〕及内胚层细胞，如肝细胞和胰岛细胞〔11，12〕。

研究证实MSCs在体内外均可以分化为神经细胞。Sanchez等〔13〕用脑源性神经生长因子(BDNF)及全反式维甲酸(ATRA)在体外将大鼠和人的MSCs定向诱导成神经细胞。Woodbury等〔14〕将大鼠骨髓MSCs先用DMEM和β-巯基乙醇诱导，再由DMEM、巯基乙醇(BME)组成的神经元诱导介质和DMEM、DMSO、丁羟茴醚(BHA)诱导介质诱导MSCs产生神经元表型，这些细胞表达NSE、NeuN、NF-M等神经元标志。Kopen等〔10〕向新生鼠侧脑室注射骨髓MSCs以求证这些骨髓来源的多能MSCs在暴露于脑组织的微环境中是否可以转变为神经细胞。结果发现在注射2 d后，MSCs经过前脑，小脑迁移入受者脑组织，且未有MSCs的破坏。位于纹状体及海马分子层中的MSCs表达神经胶原纤维蛋白，分化为成熟的星形胶质细胞。在脑干网状结构内发现有阳性的供者神经元细胞，提示MSCs可能已分化为神经元。Kohyama等〔15〕的研究发现MSCs诱导生成的神经元样细胞具有神经功能，它们能对去极化刺激有反应，乙酰胆碱能快速并可逆地增加钙离子内流，这同神经元的反应是相同的。因此移植MSCs治疗神经系统疾病是可行的。

2.2 MSCs具有“归巢” MSCs有归巢现象，尤其组织有损伤或在病理条件下。在体内，植入的MSCs可以在体内损伤组织微环境的作用下，迁移定位并分化为相应的组织细胞〔16，17〕。

MSCs自血中穿过上皮细胞，到达受损的组织，具体机制尚不清楚，研究证实MSCs表面表达多种趋化因子受体、选择素和细胞黏附分子，从而可促使MSCs向不同组织迁徙，这将使MSCs支持组织再生，修正遗传缺陷，减缓慢性炎症反应，以及用这些细胞作为生物制剂或基因良好载体成为可能。

2.3 MSCs的免疫调节作用 MSCs属于未成熟的成体干细胞，自身免疫原性低，同种异体移植后无排斥反应或反应较弱〔18〕，在外周耐受，移植耐受，自身免疫，肿瘤逃逸以及母-胎儿耐受过程中是重要的免疫调节剂〔19，20〕。MSCs能够抑制T细胞和 NK 细胞行使功能〔21，22〕;Corcione等〔23〕的实验证实 MSCs能显著减少B淋巴细胞IgM、IgG、IgA的分泌;最近有学者利用MSCs的免疫调节治疗自身免疫性疾病的患者，收到很好的临床效果〔24〕。另外我们注意到MSCs的免疫抑制作用在治疗剧烈移植物抗宿主病(GVHD)时是非常重要的，但对于肿瘤的治疗，由于移植的MSCs的免疫抑制作用可能会导致对肿瘤细胞免疫反应的下降，限制MSCs在肿瘤治疗中的应用。

3 MSCs治疗神经变性疾病的进展

3.1 MSCs治疗PD研究 目前PD临床以药物治疗为主。左旋多巴可以改善临床症状，但仅是一种递质替代治疗，不能中止或逆转病程，而且服用时间长会出现剂末现象、开关现象等一系列并发症。外科治疗尤其是脑深部刺激治疗PD虽然取得了一定的效果，但脑深部刺激治疗对自主神经症状和认知障碍无明显疗效，且有颅内出血、癫痫和一过性抑郁等并发症。如何预防或治疗上述这些并发症一直是令临床医生棘手的难题，目前还没有有效手段来防止这些并发症。最根本的原因是不论是递质替代治疗还是外科手术治疗都不能改善脑内环境，不能增加多巴胺能神经元的数目，相反由于多巴的神经毒性和电极的刺激还会使神经细胞的数目进一步减少，因此寻求一种从病因上增加神经系统细胞数目的治疗具有更重要的意义。

移植多巴胺能神经元替代已经变性的神经元，恢复黑质纹状体多巴系统的完整性并改善其功能，很可能是一项非常有前途的治疗措施。Ye等〔25〕证明了骨髓MSCs纹状体内移植可减轻 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTT)诱导的 PD 大鼠模型的运动功能障碍。Jin等〔26〕观察移植MSCs于正常大鼠纹状体内后，对脑内酪氨酸羟化酶(TH)蛋白以及多巴胺(DA)蛋白表达的影响，发现移植细胞的纹状体内不但TH蛋白和THmRNA的水平明显增高，而且DA的表达较非移植细胞的纹状体内明显增高，与此同时，移植的MSCs分化为神经元、星形细胞和少突胶质细胞。MSCs移植治疗PD的可行性打破了脑细胞受损后不能再生和功能不能恢复的观点，为中枢神经系统的功能重建提供了新的途径。近年来随着基因工程技术的发展，学者尝试将转基因技术与干细胞移植相结合治疗PD。Schwarz等〔27〕在体外获取纯化的骨髓MSCs，然后将TH和三磷酸鸟苷(GTP)水解酶I的基因转入MSCs中。将此细胞输入到帕金森病的兔模型中，发现这些被转入的基因能够在体内持续表达9 d，MSCs在体内存活达 87 d。学者 Venkataramana〔28〕将 7 位帕金森患者自体骨髓来源的MSCs通过脑立体定位仪单侧移植入侧脑室旁区域，患者平均年龄22～62岁，发病时间(14.7±7.56)个月，随访10～36个月，发现3名患者UPDRS评分明显改善，面部表情，步态以及冻结发作均明显改善，2个病人减少了口服的治疗药物，这些结果表明，脑入移植自体骨髓MSCs是安全的，MSCs移植治疗PD的可行性打破了脑细胞受损后不能再生和功能不能恢复的观点，为中枢神经系统的功能重建提供了新的途径。但是真正走上临床还需要进行大宗的临床的非随机实验研究。

3.2 MSCs治疗AD研究 AD是一种中枢神经系统变性疾病，主要表现为进行性认知功能和记忆功能障碍，大部分AD病人生活不能自理。发病年龄为40～90岁，大部分在65岁以后，是老年人群中痴呆最常见的病因。研究发现AD病人脑内Meynert核的胆碱能神经元发生明显的退行性病变，海马中的胆碱能神经元选择性丧失功能，大脑皮质中乙酰胆碱酯酶(AChE)和胆碱乙酰化酶(ChAT)水平下降〔29，30〕，不仅老年人患AD，30～50岁的青壮年也会患病，但能够确诊的病人大部分在65岁以上。AD发病的早期形式多发生在青年人，仅占总发病人数的10%以下，一般认为是由家族遗传导致的。

目前对AD的治疗尚无很好的方法，主要应用AChE抑制剂类药物和神经保护因子来缓解症状。2010年日本科学家Toda〔31〕提出，AChE抑制剂是目前姑息治疗 AD的临床有效药物，但是由于对周围器官的副作用，致使临床效果有限。AD患者除了有记忆缺陷外，常合并有情感抑郁，因此认为同时抑制AChE和5-羟色胺(5-HT)受体的拮抗剂将是很好的治疗方法。另外近年来在许多临床前期模型实验中认为美金刚〔32〕可以改善学习和记忆能力。但是这些药物均只能改善症状，不能延缓病情发展。

随着干细胞生物学的发展，干细胞替代治疗作为一种新的治疗方案得到人们的重视。已证实在AD病人的脑内有严重的Aβ沉积，主要是由于β和α分泌酶降解淀粉样β前体蛋白(APP)所致。有报道表明，将人脐带血单个核细胞(其中富集有脐带血MSCs)移植到APP转基因小鼠脑内后能够明显地缓解小鼠的AD症状〔33〕。最新研究表明α分泌酶消化APP后形成的蛋白sAPPα，是一种有效的NTFs，与神经生长因子(NGF)和视黄酸(RA)协同能够提高骨髓来源的成体干细胞向胆碱能神经元的转分化率。这就表明将间充质干细胞和sAPPα联合使用也许是治疗AD的一种新的有效的方法〔34〕。以上进展表明MSCs移植后能够不同程度地缓解AD的症状，在AD的治疗中表现出很好的潜力。近年来很多学者〔35〕认为基因治疗有可能是肯定的、有效地治疗AD的方法，其中包括脑源性神经营养因子(BDNF)、NGF、Aβ降解酶等。但目前研究多限于模型动物，真正用于人的AD临床治疗之前，仍然面临很多难题。比如如何决定干细胞的移植剂量、如何有效选择干细胞的移植位点、干细胞的长期疗效怎样等等。

3.3 MSCs治疗HD研究 HD又称为慢性进行性舞蹈病，该病以慢性进行性舞蹈样异常运动、精神异常、认知障碍三联征为主要临床特征。HD无种族差异性，人群发病率约为5/10万，发病年龄为3～70岁，多于35～45岁发病，病程缓慢进展。患者常在发病前把疾病基因遗传给下一代，通常在中年时发病，随着病情的发展症状加重，出现迅速的不随意运动，讲话和吞咽困难，认知能力减退、消沉，偶尔出现错觉、幻觉以及精神分裂症。患有HD的人通常在第一次出现症状后的8～25年内死亡，尽管药物可以缓解一些症状，但至今尚无任何有效方法对其进行彻底根治。

早在上个世纪九十年代就有研究小组尝试移植人胎儿纹状体组织来治疗HD〔36～38〕，这些研究支持了“细胞移植能够替代损伤的神经元，并且能够重新建立神经连接”的假说。最近一些实验室尝试了用干细胞治疗HD，取得了一定的进展。Lescaudron等〔39〕将自体骨髓基质干细胞移植到HD大鼠模型脑内损伤的纹状体，结果发现移植的细胞部分表现神经细胞表型，HD大鼠的记忆功能得到改善。

3.4 MSCs治疗ALS研究 ALS是一种致命性的进行性运动神经元变性疾病。最常见的类型以脊髓前角运动神经元、脑干后组运动神经核及锥体束的慢性进行变性，上下运动神经元同时受损导致神经元细胞变性死亡为特征。ALS发病呈全球分布，国外发病率为2/10万，多数患者在50岁以后出现症状，发病随年龄增加10岁而增加。通常发展缓慢，从发病到瘫痪直至死亡一般约为3～5年。发病机制迄今不详。一小部分ALS病例是由过氧化物歧化酶Ⅰ(SOD1)基因突变造成神经元的蛋白毒性，进而引起胆碱能运动神经元的死亡或功能紊乱而引起〔40〕。到目前为止，临床上仍然没有有效的治疗方法，Riluzole是目前惟一被美国FDA批准用于ALS治疗的药物，无论是对延髓麻痹还是肢体瘫痪为首发症状的ALS患者都有一定疗效。但它仅可以延缓ALS的进展〔41〕，不能改善症状或逆转进行性恶化的趋势。鉴于药物治疗ALS未有显著效果，亦不能阻止其进一步恶化的窘境，于是干细胞治疗ALS应运而生，即用干细胞产生的新神经细胞替代那些在ALS变性疾病过程中丢失的神经细胞，从而使疾病得到治疗，干细胞替代治疗可能是一种能彻底治愈ALS的方法〔42〕。学者分别从ALS患者及正常人骨髓中获得的MSCs具有同样的表型，同样的分化为脂肪细胞、成骨细胞和神经元样细胞，这些结果证实体外扩增ALS患者骨髓MSCs与正常人骨髓MSCs相比没有功能的改变，包括染色体的改变和细胞老化〔43〕。近年 Mazzini等〔44〕将分离ALS患者的自体骨髓MSCs，体外扩增后重悬于病人自体的脑脊液，然后移植入患者的脊髓。接受移植的7位病人均没有呼吸衰竭或死亡等严重的副作用，仅仅有轻微的肋间痛和腿部感觉异常，而且6 w后消失。移植后病人的脊髓体积没有被改变，也没有异常的细胞增殖现象，其中4位病人在接受骨髓MSCs移植36个月后肺活量线性下降明显减慢。这一结果表明，骨髓MSCs应用于ALS的治疗是安全的，没有明显的急慢性毒性〔45〕。Choi〔46〕从 ALS 患者骨髓中分离获得 MSCs，体外扩增培养第三代细胞，生长速度最快，建议体外培养早期传代获得的MSCs因其稳定性好，抗炎效果好，神经保护作用明显，适合移植治疗ALS。

4 存在问题和前景

MSCs生物学特性为神经系统疾病的治疗尤其是神经系统变性疾病的治疗带来了希望，展示美好的前景，但是真正走上临床还有一段极为坎坷的路〔47〕。干细胞的自我更新能力包含着一层含义就是能够无限的增殖和生长，很显然的呈现在我们面前两个问题:首先，我们在应用MSCs进行移植治疗时，是否会因为它的无限增殖能力而转变成为恶性增生呢?其次，一旦发生了肿瘤，那么它是来源于受体本身的组织还是来自移植的MSCs呢?因此，我们需要深入研究不同组织来源的MSCs分化能力和趋式、向不同细胞定向分化体系以及和不同因素相结合作用后效果等，有望更好地、安全、有效地服务于临床。

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