Folin-Ciocaileu 比色法测定不同产地生姜中总酚

张科卫，马彩霞，缪六舒

(1.南京中医药大学药学院，江苏南京210046;2.南京中医药大学江苏省中药炮制重点实验室，江苏南京210029)

生姜为姜科植物姜Zingiber OfftcinaleRosc.的新鲜根茎，味辛，性微温。该植物药食两用，同时也是常见的中药炮制辅料，为历版《中国药典》所收载，既可作为调味品，又具有很好的药用价值。具有解表散寒、温中止呕、化痰止咳、解鱼蟹毒的功能。主要用于风寒感冒，胃寒呕吐，寒痰咳嗽，鱼蟹中毒等。

文献研究表明，生姜的辛辣味主要是其中含有姜辣素类物质，该类物质是酚的同系物，对鲜姜的化学成分研究表明，其中除6-姜酚外，还含有4-、7-、8-、10-姜酚，4-、6-、8-、10-、12-姜醇，5-脱氧姜辣素、甲基-6-异姜酚、6-异姜烯酚、6-、8-、10-、12-姜二酮等多种酚类成分［1-3］。

生姜由于具有很好的抗氧化性能，目前在化妆品、食品添加剂、洗涤护肤等方面应用广泛。现代药理学研究表明，生姜中的姜酚类物质具有抗氧化［4］、抗肿瘤［5］、抗神经损伤和细胞保护［6］、抗呕吐［7］等药理活性。研究表明，6-姜酚具有抗炎活性，在体内、体外试验中，该化合物均在分子水平显示出能调节相应的细胞信号传导通路的作用［8-10］;10-姜酚、8-姜醇、10-姜醇等均具有抑制COX-2的作用［11］。

《中国药典》2010年版仅测定了生姜中6-姜酚的含有量，对于其它酚类化合物的含有量没有相应的测定方法。国内文献也尚未见有关生姜中总酚含有量测定的相关报道。

本实验建立了生姜中总酚的测定方法，同时对我国不同地域的生姜中总酚量进行了测定，一来为生姜的质量控制奠定基础，二来也为生姜的合理应用提供试验和理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器岛津UV—2401紫外可见分光光度计;Sartorius BP211D型电子天平;TCG—16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试药没食子酸对照品(110831-200803，中国药品生物制品检定所，供定量测定用);水为二次蒸馏水;其它试剂均为国产分析纯。

生姜产地分别为四川西昌、海南海口、湖南永州、福建永春、江西赣州、浙江台州、山东信丰、山东沂蒙山、四川德阳、江苏徐州。以上生姜均为2012年5月收集得到。

2 方法与结果

2.1 试剂的配制

2.1.1 对照品溶液的制备精密称取没食子酸对照品适量，置于50 mL量瓶中，加80%乙醇稀释至刻度，摇匀，制成0.203 mg/mL的对照品贮备液。

2.1.2 供试品溶液的制备取生姜药材，洗净，拭干，切成细末，精密称取该细末约20.0 g，加80%乙醇30 mL，浸泡1 h，超声(工作频率40 kHz，功率250 W)30 min，离心(4 000 r/min)5 min，取上清液置50 mL量瓶中，残渣加80%乙醇洗涤两次，每次5 mL，同前离心，合并上清液，加80%乙醇定容，摇匀。即得。

2.1.3 FoLin-Ciocaileu试剂的制备称取20.0 g钨酸钠和5.0 g钼酸钠置于圆底烧瓶中，加140 mL水溶解，加入85%磷酸溶液10 m L和浓盐酸20 mL，溶解后混匀，文火回流10 h，然后加入3.0 g硫酸锂及15 mL双氧水，加热沸腾15 min至亮黄色，不得带微蓝和绿色。冷却，移入250 mL棕色量瓶中，加水定容，摇匀，暗处保存。

2.2 测定波长的选择精密吸取对照品溶液和供试品溶液各0.1 mL，分别加80%乙醇0.4 mL，加3 mL水，加10%福氏试剂2.5 mL，加7.5%碳酸钠2.0 m L，加水2.0 mL，混匀，45℃水浴40 min，取出，摇匀，室温放置10 min后，于400～800 nm范围内进行光谱扫描，结果表明，对照品溶液和供试品溶液的最大吸收波长均为765 nm，见图1。

图1 对照品(没食子酸)(A)和样品(四川西昌生姜总酚)(B)的紫外光谱图

2.3 标准曲线的绘制精密吸取对照品贮备液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分别加80%乙醇0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.0 mL，加3 mL水，加10%福氏试剂2.5 mL，加7.5%碳酸钠2.0 mL，加蒸馏水2.0 mL，混匀，45℃水浴40 min，取出，摇匀，室温放置10 min后，765 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线，求得回归方程为Y=0.080 9X+0.079 8，r=0.999 9。线性范围为2.03～10.15 μg/mL。

2.4 精密度试验取质量浓度为6.09 μg/mL的对照品溶液，重复测定6次，记录其吸光度的值，RSD为0.14%，结果表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验精密吸取新鲜配制的生姜供试品(四川西昌)溶液0.1 mL置于10 mL的棕色具塞试管中，照2.2项下操作，分别于0、0.5、1、1.5、2 h测定其吸光度，RSD为0.34%，结果表明本法所测样品在2 h内保持稳定。

2.6 重复性试验取产自四川西昌的生姜药材，洗净，拭干，切成细末，分别精密称取该细末约20.0 g，平行6份。分别制成供试品溶液，照2.2项下操作，结果其中所含总酚的平均质量分数为0.080%，RSD为0.64%，结果表明所测样品的重复性良好。

2.7 加样回收率试验取没食子酸对照品适量，加80%乙醇溶解，配成质量浓度为0.805 4 mg/mL的溶液，作为加样对照品贮备液。取产自四川西昌的生姜药材，洗净，拭干，切成细末，精密称取该细末约10.0 g，平行6份，精密加入加样对照品贮备液10.0 mL，加80%乙醇20 mL，照2.1.2项下操作，测定吸光度的值并计算回收率，得平均回收率为100.53%，RSD为1.07%。结果见表1。

表1 加样回收试验结果

2.8 样品的测定取各产地的生姜药材，洗净，拭干，切成细末，各精密称取约20.0 g，每个产地平行3份，按供试品溶液制备方法制备。精密吸取上述各供试品溶液0.1 mL置10 mL的棕色具塞试管中，照2.2项下操作，测定吸光度的值，每份平行测定两次。根据标准曲线计算其中总酚的含有量。结果见表2。

表2 不同产地的生姜所含总酚的质量分数(n=6)

3 结论

3.1 我国为生姜生产大国，每年有大量的生姜出口，山东、四川、湖南、江西、福建、江苏、浙江等省为生姜的种植大省。本课题组根据我国的生姜种植情况，共收集了10个产地的生姜:山东信丰、山东沂蒙山、四川西昌、四川德阳、湖南永州、江西赣州、福建永春、浙江台州、江苏徐州、海南海口。这些生姜都是当地农家种植的有机生姜，由于生姜采收期为每年的9、10月份，刚采收上来的姜称为“嫩姜”，我们收集的时候已经是次年的5月份，这个时候是“老姜”，也就是我们平时见到的生姜。这些都是从当地农民家的地窖里取出来的。从外形看，除山东和徐州的生姜个头较大外，其它产地的生姜个头都比较小，也就是我们常说的“本生姜”。

3.2 本实验对从全国不同地区收集来的生姜进行了总酚量的测定，结果表明，全国不同地区的生姜中总酚类成分量存在较大差异，最高的为海南海口产的生姜，质量分数高达0.108%;最低的为山东信丰和江苏徐州产的生姜，质量分数为0.054%，仅为海南海口产生生姜的1/2。推测可能与生姜的生长环境及气候等因素有关。

3.3 在实验过程中，我们参考相关文献［12-13］，考察了试剂的用量、反应的温度及时间等因素对显色稳定性的影响。

3.3.1 由于生姜中的姜酚类物质水溶性比较差，因此在选择提取溶剂时，我们考察了50%、60%、80%的乙醇作为提取溶剂，发现，采用80%乙醇为溶剂，超声30 min所得的溶液显色后测定结果较稳定。

3.3.2 由于实验过程中使用的试剂如福氏试剂、碳酸钠等均为水溶性试剂，在高浓度的乙醇溶液中会结晶析出，影响最终显色反应后溶液的澄明度，经多次实验最终确定了“加10%福氏试剂2.5 mL，加7.5%碳酸钠2.0 mL，加水2.0 mL”，在这样的试剂比例下，显色溶液的澄明度和稳定性都较高。

3.3.3 在考察反应温度和时间的实验时，我们发现，使用45℃的水浴40 min反应条件比较温和，在该条件下，显色稳定，灵敏度高，结果可靠。

综合以上预试验结果，本实验最终确定了0.1 mL供试品溶液加80%乙醇0.4 mL，加3 mL水，加10%福氏试剂2.5 mL，加7.5%碳酸钠2.0 m L，加水2.0 mL，混匀，45℃水浴40 min，取出，摇匀，室温放置10 min后，于765 nm处测定含有量的方法。

［1］Wohlmuth H，Leach D N，Smith M K，et al.Gingerol content of diploid and tetraploid clones of ginger(Zingiber officinaleRoscoe)［J］.J Agric Food Chem，2005，53(14):5772-5778.

［2］Jolad S D，Lantz R C，Solyon A M，et al.Fresh organically grown ginger(Zingiber officinale):composition and effects on LPS-induced PGE2 production［J］.Phytochemistry，2004，65(13):1937-1954.

［3］Jolad S D，Lantz R C，Chen G J，et al.Commercially processed dry ginger(Zingiber officinale):composition and effects on LPS-stimulated PGE2 production［J］.Phytochemistry，2005，66(13):1614-1635.

［4］Chakraborty D，Mukherjee A，Sikdar S，et al.［6］-gingerol isolated from ginger attenuates sodium arsenite induced oxidativestress and plays a corrective role in improving sulin signaling in mice［J］.Toxicol Lett，2012，210(1):34-43.

［5］Weng C J，Yen G C.Chemopreventive effects of dietary phytochemicals against cancer invasion and metastasis:phenolic acids，monophenol，polyphenol，and their derivatives［J］.Cancer Treat Rev，2012，38(1):76-87.

［6］Shim S，Kim S，Kwon Y B，et al.Protection by［6］-shogaol against lipopolysaccharide-induced toxicity in murine astrocytes is related to production of brain-derived neurotrophic factor［J］.Food Chem Toxicol，2012，50(3-4):597-602.

［7］Kawai T，Kinoshita K，Koyama K，et al.Anti-emetic principles ofMagnolia obovataBark andZingiber officinale rhizome［J］.Planta Med，1994，60(1):17-20.

［8］Kim J K，Kim Y，Na K M，et al.［6］-gingerol prevents UVB-induced ROS production and COX-2 expression in vitro and in vivo［J］.Free Radic Res，2007，41(5):603-614.

［9］Park Y J，Wen J，Bang S，et al.［6］-gingerol induces cell cycle arrest and cell death of mutant p53-expressing pancreatic cancer cells［J］.Yonsei Med J，2006，47(51):688-697.

［10］Kim S O，Kundu J K，Shin Y K，et al.［6］-gingerol inhibits COX-2 expression by blocking the activation of p38 MAP kinase and NF-kappaB in phorbol ester-stimulated mouse skin［J］.Oncogene，2005，24(15):558-2567.

［11］Van Breemen R B，Tao Y，Li W K.Cyclooxygenase-2 inhibitors in ginger(Zingiber officinale)［J］.Fitoterapia，2011，82(1):38-43.

［12］杨磊，隋小宇，祖元刚，等.Folin-Ciocalteu法测定迷迭香中总酚酸含量［J］.中成药，2009，31(2):272-275.

［13］何文静，张帆，田树革，等.Folin-Ciocaileu比色法测定啤酒花中总多酚的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(5):58-59，60.