银杏叶细粉与超微粉中总黄酮体外浸出量的比较研究

2012-01-26黄其春林艺丹林梅香洪燕萍杨小燕

中成药 2012年12期

黄其春，林艺丹，林梅香，洪燕萍，杨小燕，3*

(1.龙岩学院生命科学学院，福建龙岩364000;2.预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室，福建龙岩364000;3.福建省人畜寄生与病毒性疫病防控工程技术中心，福建龙岩364000)

银杏Ginkgo BilobaL.是世界上最古老的植物，为我国特有树种，拥有量占世界总量的70%以上［1］。银杏的药用价值主要在其叶和果实，银杏叶被用作药物已有500余年的历史，早在宋朝我国民间就使用银杏叶治疗哮喘和支气管炎。现代药理学研究表明，银杏叶中主要有效成分为黄酮类化合物、萜类化合物和聚戊烯醇等［2-3］，其中银杏黄酮具有扩张血管、抑制血小板活化因子、抗氧化、降血脂等作用［4-5］，对治疗冠心病、心绞痛、高血压和支气管哮喘等有显著效果。鉴于银杏黄酮具有独特的药理作用、临床治疗和保健价值，把银杏叶黄酮类化合物开发成药品和保健食品的研究已成为一个研究热点，而且新的银杏叶提取纯化工艺及新的测定方法研究也越来越受人们关注。

目前，银杏叶的提取方法主要有有机溶剂浸取法、水浸取法、超声波提取法等［6］，其中有机溶剂浸取法应用最为广泛。刘荣改等［7］在银杏叶的有机溶剂提取工艺基础上引入超微粉碎技术，结果发现超微粉碎技术能改善银杏叶的提取工艺。黄其春等［8］以水为溶出介质，研究超微粉碎对银杏叶中总黄酮溶出量的影响，结果发现超微粉碎能提高银杏叶中总黄酮的溶出量。中药经超微粉碎后，细胞的破壁率≥90%，细胞内的有效成分充分暴露出来，其释放速度及释放量大幅度提高，增加了中药的体外浸出度，从而提高药效、节约资源、降低成本，使超微粉碎技术在中药领域显现出特有的优势和广阔的应用前景［9-10］。但是，有关超微粉碎技术对银杏叶中总黄酮在动物胃肠道中浸出的影响，还未见相关研究报道。为此，本试验模拟胃肠道的不同pH条件，对银杏叶细粉与超微粉中总黄酮的体外浸出情况进行比较研究，旨在为进一步开发利用我国丰富的银杏叶资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 银杏叶细粉和超微粉银杏叶购自陕西中鑫生物技术有限公司，银杏叶细粉和超微粉委托江西省千目高科有限公司制备。

1.1.2 试剂芦丁购自国药集团化学试剂有限公司，乙醇、氯化钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、盐酸均为分析纯。

1.1.3 主要实验仪器AL104—1C电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);pH s—25数显酸度计(上海精密科学仪器有限公司);BSD—250恒温振荡培养器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)和UV—3200 PCS紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 最大吸收波长的确定取少量芦丁，用乙醇溶解后，再用原液(pH=2.23的浸出介质，见表1)定容，静置15 min，以原液为空白，在UV-3200 PCS紫外可见分光光度计上从波长200～600 nm范围内进行扫描，确定最大吸收波长。

1.2.2 线性关系考察银杏叶中总黄酮量的测定采用分光光度法［11］。准确称取经干燥至恒质量的芦丁标准品10 mg，用10 mL乙醇溶解后，用原液定容至50 mL，配成0.2 mg/mL芦丁标准液。分别准确吸取该芦丁标准液0.000、0.125、0.250、0.375、0.500、0.625、0.750 mL于量瓶中，用原液定容至5 mL，静置15 min后，以芦丁质量浓度为0.000 mg/mL的标准溶液为参比，在最大吸收波长处测定吸光度，以芦丁质量浓度X为横坐标，吸光度Y为纵坐标，计算标准曲线的回归方程。

1.2.3 精密度实验准确吸取芦丁标准液0.5 mL于量瓶中，用原液定容至5 m L，在最大吸收波长处测定吸光度，连续测定6次，结果RSD为0.16%，说明精密度良好。

1.2.4 重复性试验准确吸取同一批次银杏叶超微粉浸出滤液6份，每份0.5 mL，分别用原液定容至5 mL，在最大吸收波长处测定吸光度，根据所建立的标准曲线回归方程计算总黄酮量，结果RSD为0.50%，表明实验重复性良好。

1.2.5 稳定性试验准确吸取银杏叶超微粉浸出滤液1.0 mL于量瓶，用原液定容至10 mL，在最大吸收波长处测定吸光度，每隔2 h测定1次，共测定5次，根据所建立的标准曲线回归方程计算总黄酮量，结果RSD为0.42%，表明样品溶液在8 h内的稳定性良好。

1.2.6 加样回收试验准确吸取已知总黄酮量的银杏叶超微粉浸出滤液9份，每份0.5 mL，分别加入高、中、低3个梯度的芦丁标准品(芦丁加入量分别是样品总黄酮量的80%、100%、120%，每个梯度3份)［12］，用原液定容至5 mL，在最大吸收波长处测定吸光度，根据所建立的标准曲线回归方程计算总黄酮量，并计算加样回收率［13］，结果平均回收率为99.90%，RSD为0.67%，表明样品回收率良好。

1.2.7 银杏叶中总黄酮体外浸出量的测定按表1制备原液和Ⅰ～Ⅳ号浸出介质，模拟胃肠道不同的pH条件［14］。取适量的原液于37℃恒温振荡器中预热。分别称取15 g银杏叶细粉和超微粉于具塞三角锥形瓶中，加入30倍药量已预热的原液，在转速为100 r/min、温度为(37±0.5)℃的浸出条件下振荡。当银杏叶细粉和超微粉完全浸入到原液中后开始计时，按表2中的取样时间用针头过滤器吸取浸出液2.5 mL，随即补充同温度同体积的Ⅰ～Ⅳ浸出介质。取适量的续滤液，按上述方法在最大吸收波长处测定吸光度后由标准曲线回归方程计算得出其中的总黄酮量，然后按以下公式计算出各个取样时间点总黄酮的累积浸出量［15］。各取样时间点总黄酮的累积浸出量(mg/g)=［Cn×b×V2+(Cn－1+Cn－2+…+C2+C1)×b×V1］/m，其中Cn为所测样品质量浓度(mg/mL)、V2为浸出介质总体积(mL)、V1为取样体积(mL)、b为稀释倍数、m为样品加入量(g)。

表1 不同pH浸出介质的组成

1.2.8 数据统计分析数据以“平均值±标准差”表示，采用SPSS13.0软件中ANOVA模块进行统计分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定黄酮类化合物在190～400 nm的区域内存在两个主要的紫外吸收带，即峰带Ⅰ(300～400)nm和峰带Ⅱ(220～280)nm。紫外扫描结果表明，芦丁在波长255 nm和350 nm处均有最大吸收峰，而且在波长350 nm处吸收峰明显。考虑到许多物质(溶剂等许多非黄酮类物质)在波长258 nm左右均有吸收，杂质干扰大，因此选择350 nm作为测定波长。

2.2 线性关系的考察求得标准曲线的回归方程为Y=24.971X+0.009 1，相关系数r=0.999 9，表明芦丁溶液在0.000～0.030 mg/mL的质量浓度范围内，其质量浓度与吸光度呈良好的线性关系。

2.3 银杏叶中总黄酮的浸出量银杏叶中总黄酮的浸出量见表2。由表2可知，在模拟胃肠道的浸出介质中，银杏叶细粉和超微粉中总黄酮的累积浸出量随着浸出时间的增加而增加。在浸出的起始阶段(15～180 min)，银杏叶细粉和超微粉中总黄酮均有一个较快的浸出过程，随后总黄酮的浸出速度逐渐减慢，银杏叶细粉中总黄酮在4 h后基本不再浸出，银杏叶超微粉中总黄酮仍有少量浸出。在各个取样时间点，银杏叶超微粉中总黄酮的累积浸出量均显著高于银杏叶细粉中总黄酮的累积浸出量(P＜0.01)，其增加幅度达7.4%～21.7%。

表2 银杏叶细粉和超微粉在不同取样时间点总黄酮的累积浸出量

3 讨论

目前，超微粉碎技术在中药领域已显现出特有的优势，并广泛应用于中药生产。刘荣改等［7］、黄其春等［7］分别报道超微粉碎技术能改善银杏叶的提取工艺、提高银杏叶中总黄酮的溶出量。但是，有关超微粉碎技术对银杏叶中总黄酮在动物胃肠道中浸出的影响还未见报道。本试验模拟胃肠道的不同pH条件，对银杏叶细粉与超微粉中总黄酮的体外浸出情况进行了比较研究。为更好地模拟药物在胃肠道中的转运情况，除配制不同pH值的缓冲液作为浸出介质外［14］，取样时间的设定主要是参考药物在胃中(pH 2.23～4)停留约2 h，小肠中(pH 7.4左右)停留约4 h，大肠中(pH 7.8以上)停留约2 h而确定的。前4 h pH变化大，取样间隔为15 min;后4 h pH变化小，取样间隔为30 min［16］。试验结果表明，在模拟胃肠道的浸出介质中，银杏叶细粉和超微粉中总黄酮在起始的15～180 min浸出较快，前4 h(pH 2.23～6.96)的浸出量较多。而在后4 h(pH 7.06～8.5)，银杏叶细粉中总黄酮基本不再浸出，银杏叶超微粉中总黄酮仍有少量浸出。在各个取样时间点，银杏叶超微粉中总黄酮的累积浸出量均显著高于银杏叶细粉中总黄酮的累积浸出量(P＜0.01)。究其原因，可能与银杏叶细粉和超微粉细胞壁完整性、粒径以及比表面积大小有关。银杏黄酮等有效成分主要存在于银杏叶的细胞质中，在细胞壁完好的情况下，黄酮等有效成分需经过浸润、溶胀、渗透和扩散等过程，方能从细胞质中穿过细胞膜和细胞壁扩散到浸出介质中，这一过程进行的比较缓慢，而且不能进行完全。银杏叶经过超微粉碎后，难以看到完整的细胞结构，细胞破壁率很高，粒径变小，比表面积增大［8，17］，这不仅使黄酮等有效成分充分暴露出来，其浸出不受细胞膜和细胞壁的阻碍，直接溶解到浸出介质中，而且还使黄酮等有效成分与浸出介质间的有效接触面积增大，浸出介质进入颗粒中心的距离缩短，进而导致黄酮等有效成分浸出速度加快，浸出量增加，该过程进行很快，而且比较彻底。

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