RP-HPLC法同时测定冠脉宁片中葛根素和丹酚酸B

程夏倩，张文婷，程维明，赵维良*

(1.浙江中医药大学，浙江杭州310053;2.浙江省食品药品检验研究院，浙江杭州310004)

冠脉宁片由丹参、血竭、葛根等十四味中药组成，功能活血化瘀，行气止痛，常用于以胸部刺痛、固定不移等为主症的冠心病，心绞痛，冠状动脉供血不足［1］。该品全国共有25家企业生产，11个质量标准，质量标准有单独控制葛根素或丹参素量或无定量控制。葛根素是葛根的主要有效成分之一，具有改善心脑血管循环、降低心肌耗氧量等多种药理作用［2］。因此控制葛根素的含有量可以保障有效性的同时也可以从另一方面控制葛根的植物来源。丹参酚酸类成方是丹参主要有效成分，具有抗脂质过氧化、抗血栓、改善血液循环等作用［3］，其中丹酚酸B量最高，且活性最强，选择测定丹酚酸B作为质量控制指标具有重要意义;且《中国药典》［4］中，丹酚酸B也是丹参药材质量控制指标之一。目前对葛根素、丹酚酸B等成分研究文献有较多报道［5-12］，本实验建立了RP-HPLC法同时测定冠脉宁片中的葛根素和丹酚酸B，可为冠脉宁片的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器HP1100系列高效液相色谱仪(G1322A脱气机，G1311A四元泵，G1313A自动进样仪，G1316A柱温箱，G1314A紫外检测器，Chemstation色谱工作站)。

1.2 试药葛根素对照品(中国药品生物制品检定所，批号725-200108，定量测定用)，丹酚酸B对照品(中国药品生物制品检定所，批号111562-200605，定量测定用)，甲醇、乙腈均为色谱纯，水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。冠脉宁片由12家生产企业提供共25批样品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-甲醇-0.05%磷酸水溶液梯度洗脱，洗脱条件见表1;检测波长:286 nm;柱温:40℃;体积流量:1.0 mL/min。进样量:对照品10 μL、供试品10 μL，理论板数按葛根素峰计算大于3 000。在此色谱条件下能达到很好分离，缺味样品无干扰。结果见图1。

表1 梯度洗脱顺序Tab.1 Gradient elution mode

图1 冠脉宁片HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s of Guanmaining Tablets

2.2 对照品溶液制备精密称取葛根素和丹酚酸B对照品适量，加50%甲醇分别制成每1 mL各含约95.95 μg和45.04 μg的对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备取本品10片(包衣者除去包衣)，研细，取0.25 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加50%甲醇适量，浸渍30 min后超声处理(功率300 W，频率50 kHz)30 min，放冷，加50%甲醇至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。

2.4 阴性样品溶液制备分别取缺葛根药材和缺丹参药材的片剂，按照2.3项供试品溶液的制备方法制成阴性对照样品。

2.5 线性关系考察精密吸取上述葛根素对照品溶液0.5、1、2、4、8、12、20 μL进样，上述丹酚酸B对照品溶液1、2、4、8、12、20、30、40 μL进样，记录峰面积，以色谱峰面积(Y)对进样量(X)进行回归，计算回归方程，葛根素的线性方程为Y=1.349 8X+1.862 5，r=1.000 0，丹酚酸B的线性方程为Y=1.084 6X－7.048 8，r=1.000 0，说明葛根素在进样量0.048～1.919 μg范围内有良好的线性关系，丹酚酸B在进样量0.045～1.801μg范围内有良好的线性关系。

2.6 精密度试验精密吸取葛根素和丹酚酸B对照品溶液连续进样5次，结果葛根素峰面积的RSD为0.2%，丹酚酸B峰面积的RSD为0.5%，表明仪器进样精密度良好。

2.7 重复性试验取同一批样品(厂家12，批号:091101)6份，按供试品溶液制备方法制备，结果葛根素平均质量分数为9.66 mg/g，RSD为0.4%，丹酚酸B平均质量分数为6.63 mg/g，RSD为0.8%。

2.8 回收率试验精密称取样品(厂家12，批号:091101)6份，分别精密加入葛根素对照品溶液和丹酚酸B对照品溶液适量，按正文供试品制备法制备，并依法测定，结果见表2，葛根素平均回收率为99.8%，RSD为1.5%，丹酚酸B平均回收率为108.8%，RSD为1.1%。

表2 冠脉宁片的加样回收试验结果Tab.2 Recovery test results of Guanmaining Tablets

2.9 稳定性试验精密吸取同一份供试品溶液和对照品溶液，在32 h内，每间隔1、3、11、17个小时进样1次，进样体积为10 μL，结果对照品葛根素峰面积RSD为0.2%、供试品溶液为0.4%;对照品丹酚酸B峰面积RSD为0.4%、供试品溶液为0.5%，表明供试品溶液和对照品溶液在32 h内基本稳定。

2.10 样品测定对收集到样品的12家生产企业共25批冠脉宁片按拟定的方法进行测定，结果见表3。

表3 冠脉宁片样品测定结果(n=2)Tab.3 Content determ ination of Guanmaining Tablets(n=2)

3 讨论

3.1 本实验考察了回流、超声等提取方法，根据化合物的性质，选择50%甲醇为溶剂，由于丹参为水煎煮提取，葛根为生粉入药，故选择浸渍30 min后超声提取30 min和回流提取30 min两种方法进行比较，结果葛根素量相当，丹酚酸B用回流提取略低，考虑丹酚酸B对热的不稳定性，确定提取方法为超声提取。此外，通过对溶媒种类(30%甲醇、50%甲醇和70%甲醇)、超声时间、溶液量等因素进行考察，最后确定样品的制备选择取0.25 g样品加25 mL 50%甲醇超声提取30 min，该方法操作简便易行，且避免成分损失。

3.2 本实验中，比较了乙腈－0.005%三氟乙酸溶液、乙腈－0.05%磷酸溶液、乙腈－甲醇－0.05%磷酸溶液为流动相及不同洗脱条件，考察被测组分与杂质峰的分离情况，最后选择乙腈-甲醇-0.05%磷酸水溶液梯度洗脱分离度好;比较了Agilent Extend－C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Therm Hypersil Gold(250 mm×4.6 mm，5 μm)3种色谱柱对样品进行测定，3种色谱柱所测得的样品含有量偏差在3.0%以内且3种色谱柱都有较好的分离度，同时还比较了20℃、30℃、40℃的柱温对样品进行分析，不同柱温下均有较好的分离且对含有量测定结果影响不大，葛根素RSD为2.3%，丹酚酸B RSD为1.1%。

3.3 检测波长的选择本实验采用DAD检测器对葛根素及丹酚酸B的吸收波长进行了全面的考察，葛根素最大吸收波长为250 nm、305 nm，丹酚酸B的最大吸收波长为286 nm，考虑丹酚酸B相对于葛根素量较低，且在丹酚酸B最大吸收波长处葛根素也能得到较好的分离，能完全满足定量测定的要求，故确定测定波长286 nm。

3.4 样品测定结果分析测定结果显示同一企业的不同批号产品测定结果差异较小，但不同企业产品差异大。厂家3中葛根素含量最高，为10.29 mg/片;厂家8中葛根素含量最低，为0.59 mg/片;厂家2中丹酚酸B含量最高，达13.68 mg/片;厂家5中丹酚酸B含量最低，为0.53 mg/片。不同企业产品的葛根素含量差异大的原因可能与各企业投料的原药材品种有关，12家生产企业中，4家使用粉葛投料，8家使用野葛投料，使用粉葛的厂家平均值为0.61 mg/片，而使用野葛的厂家平均值为3.09 mg/片，相差五倍之多。丹酚酸B含量测定结果相差较大的原因推测可能与丹酚酸B的不稳定性以及生产工艺中加热的参数不同有关。温度、受热时间、pH都是影响其稳定性的重要因素［9］。因此，为避免市场流通的冠脉宁片不同厂家的质量差异较大，建议各生产企业通过实验考察，细化工艺参数，量化成品指标，从而有效控制冠脉宁片的质量。

［1］卫生部药品标准(中药成方制剂第十册)［S］.1995:122.

［2］白群华，李文明，刘洪清，等.葛根素对脂多糖诱导NG小胶质细胞激活的抑制作用［J］.细胞与分子免疫杂志，2010，26(3):27-230.

［3］杜冠华，张均田.丹参水溶性有效成分-丹酚酸研究进展［J］.基础医学与临床，2000，20(5):394.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010.

［5］郑巍.高效液相色谱法测定冠脉宁片中葛根素的含量［J］.山西中医，2010，26(5):50-51.

［6］冯慧，周青，谢继安.HPLC谱法测定葛粉中葛根素含量［J］.中国食物与营养，2011，17(3):57-59.

［7］蒋珍藕，兰宝强，邱宏聪，等.HPLC法测定精制冠心片中丹酚酸B的含量［J］.中医药导报，2011，17(1):83-85.

［8］曾江洪，刘灿辉.HPLC法测定再生片中丹酚酸B的含量［J］.中医药导报，2011，1(3):95-96.

［9］朱金墙，闫晨，康立源.丹酚酸B的稳定性及其降解机理的研究进展［J］.中国中医药信息杂志，2010，17(12):113-115.

［10］张雪慧.HPLC法测定冠脉宁颗粒中丹参素钠的含量［J］.现代中医药，2008，28(1):60-61.

［11］刘必旺，李会芳，赵换，等.HPLC与TLC测定复方葛根胶囊中葛根素含量［J］.中华中医药杂志，2011，26(4):695-697.

［12］刘文斌，阎琪.高效液相色谱法测定川葛颗粒中葛根素的含量［J］.中国卫生工程学，2011，10(1):71-72.