“一测多评”法测定麦贞花颗粒中不同类型成分的含有量

刘志辉，顾玮，常星洁，严冬

(1.江苏省中医院，江苏南京210029;2.南京中医药大学，江苏南京210046)

麦贞花颗粒由麦冬、女贞子、红花、槐米等五味中药组成，具有补益心肾，化瘀通络之功效，用于冠心病心绞痛的治疗，疗效显著。现代研究表明，女贞子中的环烯醚萜类成分、红花中的水溶性色素以及槐米中的黄酮类物质均对心血管系统有较广泛的药理作用［1-3］，故选择女贞子中环烯醚萜类成分含有量较高的成分之一特女贞苷、红花中的主要活性物质羟基红花黄色素A和槐米中的芦丁作为含有量测定指标，更能体现中药复方制剂的内在质量。特女贞苷对照品价格较高且供应不足，羟基红花黄色素A对照品稳定性较差［4］，而芦丁对照品廉价易得又稳定，故本实验应用“一测多评”法［5］实现麦贞花颗粒的多指标质量控制，通过建立芦丁与其他待测成分(特女贞苷、羟基红花黄色素A)间的相对校正因子，并与外标法计算结果比较，探讨“一测多评”法在不同类型成分之间应用的可行性与适应性。

1 仪器与试药

Agilent1100高效液相色谱仪:G1322A脱气机，G1311A四元泵，G1316A柱温箱，G1314A VWD检测器，Agilent chemstation工作站;Waters2695高效液相色谱仪:2998PAD检测器，Empwer工作站。电子分析天平(BP—211D型，德国赛多利斯公司)等。

羟基红花黄色素A、特女贞苷对照品(购自南京泽郎医药科技有限公司，定量测定用，批号分别为:ZL20100901HSA和ZL20100928TNZG);芦丁对照品(购自中国药品生物制品检定所，定量测定用，批号为0080-9705)。测定用甲醇和乙腈为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 一测多评方法学考察

2.1.1 对照品溶液的配制取羟基红花黄色素A、特女贞苷、芦丁对照品适量，精密称定，加80%甲醇配制成质量浓度分别为65.80、65.02、318.18 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备精密称取麦贞花颗粒约0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，称定质量，超声30 min，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。同法制备阴性供试品溶液。

2.1.3 色谱条件Hedera C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相:甲醇(A)-0.2%磷酸水(B)，洗脱程序见表1;柱温:30℃;体积流量:1.0 mL/min。HPLC图见图1～5。

表1 梯度洗脱顺序Tab.1 Gradient elution mode

图1 对照品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of reference substance

图2 供试品HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of samp le

图3 红花阴性样品HPLC色谱图Fig.3 HPLC chorm atogram of negative sam p le w ithout Cartham i Flos

图4 女贞子阴性样品HPLC色谱图Fig.4 HPLC chormatogram of negative sam ple w ithout Ligustri lucidi Fructus

图5 槐米阴性样品HPLC色谱图Fig.5 HPLC chromatogram of negative sam ple w ithout Sophorae Flos

2.1.4 线性关系精密吸取上述混合对照品溶液1、2、4、6、10、15、20 μL进样分析，以进样量对峰面积积分值进行回归处理，分别得羟基红花黄色素A、特女贞苷和芦丁的回归方程见表2。

表2 麦贞花颗粒中3种有效成分的标准曲线Tab.2 Standard curves of three active com pounds in Maizhenhua Granules

2.1.5 精密度精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录羟基红花黄色素A、特女贞苷和芦丁的峰面积，RSD分别为0.20%，0.29%，0.29%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性取麦贞花颗粒0.5 g，平行6份，精密称定，按供试品溶液处理方法制备样品，测定羟基红花黄色素A、特女贞苷和芦丁平均质量分数为0.287、3.76、12.24 mg/g，RSD分别为0.20%，0.29%，0.29%。

2.1.7 稳定性精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于配制后的0、4、8、12、24 h测定峰面积积分值，羟基红花黄色素A、特女贞苷和芦丁24 h内峰面积的RSD分别为1.80%、1.20%、0.93%，表明处理后的供试品溶液在24 h内稳定。

2.2 相对校正因子计算以芦丁为内标，按公式fkm=fk/fm=(Wk×Am)/(Wm×Ak)［5］，Ak为内标物峰面积，Wk为内标物质量浓度，Am为其他组分m峰面积;Wm为其他组分m质量浓度。分别计算芦丁对特女贞苷和羟基红花黄色素A的校正因子，见表3。

表3 芦丁对特女贞苷和羟基红花黄色素A的校正因子Tab.3 Correction factor of rutin on specnuezhenide and hydroxysafflor yellow A

2.2.1 校正因子重现性考察取混合对照品溶液，分别进样5、10、15 μL，计算芦丁对特女贞苷、羟基红花黄色素A的校正因子。实验考察了Waters2695-2998、Agilent1100两种高效液相系统，Hedera C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Sunfire C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)4种色谱柱，结果见表4。

表4 不同仪器和色谱柱测得校正因子(n=3)Tab.4 Correction factor measured by using different instruments and chromatographic columns(n=3)

2.3 待测组分色谱峰定位计算各待测组分与内参芦丁的相对保留值(r)，结果见表5。

表5 不同仪器和色谱柱测得的相对保留值(n=3)Tab.5 Relative retention measured by using different instruments and chromatographic columns(n=3)

由表可知，RSD＞5%，说明其在不同仪器和不同色谱柱上的重复性较差，用相对保留时间定位缺乏准确性。本实验采用色谱法结合光谱方法对待测色谱峰进行定位，羟基红花黄色素A、特女贞苷和芦丁的紫外吸收光谱图见图6。

虽然相对保留时间在不同仪器和色谱柱上的重复性较差，但是出峰顺序一致，由图6可知，3种成分的紫外吸收特征相差较大，且本制剂在测定波长下色谱峰较少，待测成分色谱峰附近无干扰，用色谱法结合光谱法进行待测色谱峰的定位是可行的。

2.4 一测多评法与外标法测定结果的比较分别精密吸取不同批次制剂供试品溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，测定。采用外标法和一测多评法计算麦贞花颗粒中芦丁、羟基红花黄色素A和特女贞苷的含有量，结果见表6。

图6 3种对照品的紫外吸收图谱Fig.6 UV absorption spectrum of three reference substances

表6 麦贞花颗粒中芦丁、羟基红花黄色素A和特女贞苷含有量(n=3)Tab.6 Contents of rutin，hydroxysafflor yellow A and specnuezhenide in M aizhenhua Granules

试验结果表明，采用一测多评方法及外标法所测得的麦贞花颗粒中芦丁、羟基红花黄色素A和特女贞苷的含有量基本一致，表明两种含有量测定方法得到的含有量值之间无显著性差异，说明一测多评法在麦贞花颗粒的多指标成分质量评价中应用是可行的。

3 讨论

中药多成分、多功效的作用特点决定着单一成分难以表达中药的质量，多成分同步质量控制模式应运而生，并得到了迅速普及。在中药多指标质量评价过程中，多采用指纹图谱技术来体现中药的系统性、整体性、特征性［6］，但它模糊的特点造成了在实际生产、监督中的应用难度和“难以说清楚”［7］。一测多评法用校正因子阐明了中药主要成分间的相互关系，能够实现在对照品短缺的情况下，进行多指标成分的含有量测定，有望成为适合中药特点多指标质量评价新模式。

3.1 内参物的选择羟基红花黄色素A为水溶性色素成分，稳定性差，溶液状态下易降解［8］，实验中发现其对照品溶液一段时间后峰面积有所降低，影响含有量测定的准确度。特女贞苷价格较昂贵，而芦丁对照品廉价易得又稳定，在制剂中含有量较高，因此选择芦丁为内参物来实现制剂中3种成分的同时测定，更能体现一测多评方法的简便、易操作、低成本。

3.2 检测波长的选择羟基红花黄色素A、特女贞苷和芦丁的最大吸收波长见图6，曾选择三者的共有波长区即230 nm处进行测定，在不同仪器试验时发现芦丁对羟基红花黄色素A的校正因子重现性较差，RSD＞5%。故在梯度洗脱过程中采用可变波长检测，前15 min选择羟基红花黄色素A的最大吸收403 nm。因特女贞苷与芦丁保留时间相近，考虑到不同仪器和色谱柱对保留时间的影响，故后30 min选择特女贞苷最大吸收波长230 nm进行检测，校正因子重现性良好。

3.3 关于色谱峰定位目前一测多评方法中色谱峰定位一般采用色谱法，杨芳等［9］根据内参物欧前胡素的保留时间，利用色谱峰的相对保留时间进行川白芷药材中另外2个香豆素成分定位，此方法较为简便，在待测化合物的化学性质相近的情况下使用实用性较好。但是对于不同类型化合物，采用色谱法定位误差较大，对化学性质相差较大的待测化合物而言，其紫外吸收特征差别也较大，此时可采用光谱法结合色谱法进行定位。王瑞等［10］根据内参物芍药苷的保留时间，通过相对保留值结合待测组分色谱峰的紫外吸收特征，能够正确判断目标峰的准确峰位置。本制剂中羟基红花黄色素A、特女贞苷和芦丁3种成分的紫外吸收特征相差较大，且在特定色谱条件下色谱峰较少，干扰较小，这为光谱法定位提供了可能，再结合色谱峰的相对保留时间，即可正确判断出目标峰的准确峰位置。

3.4 关于制剂的一测多评中药复方制剂较之于单味中药饮片而言成分种类更多、更复杂，因此，其一测多评的应用难度加大。若谱图中色谱峰较多，仅采用色谱法或光谱法都无法满足准确定位的要求。近年来李博岩等［11-12］提出了光谱相关色谱的新概念，即利用联用色谱的光谱信息与色谱信息，判断复杂中药色谱图中的组分相关性和表征不同实验条件下所得的中药色谱图，从而实现仪器的系统误差的化学计量学校准，使“一测多评”法在复杂中药制剂中的应用成为可能。也可以按制剂中成分种类及理化性质不同，进行相应的提取、分离、纯化等，建立两个或两个以上的一测多评的方法以进行更多成分的测定。

［1］邱蓉丽，李璘.中药女贞子化学与药理研究进展［J］.中药材，2007，30(7):891-893.

［2］李中原，涂秀华.红花黄色素的药理研究进展［J］.中药新药与临床药理，2005，16(2):153-156.

［3］吴虹霁，兰昌云，陈媛.槐花的研究进展［J］.广东微量元素科学，2006，13(6):1-5.

［4］张艳利，杨兴鑫，李晓妮.HPLC法同时测定舒心通脑胶囊中羟基红花黄素A和栀子苷含量［J］.药物分析杂志，2009，29(12):2064-2066.

［5］王智民，高慧敏，付雪涛，等.“一测多评”法中药质量评价模式方法学研究［J］.中国中药杂志，2006，31(23):1925-1928.

［6］黄晟，谷莉，黄河舟，等.中药色谱指纹图谱研究进展［J］.药学实践杂志，2003，21(6):306-329.

［7］匡艳辉，朱晶晶，王智民，等.一测多评法测定黄连中小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱、药根碱含量［J］.中国药学杂志，2009，44(5):390-394.

［8］金鸣，臧宝霞，李金荣.羟基红花黄色素A热稳定性的初步研究［J］.中国中药杂志，2003，28(12):1197-1198.

［9］杨芳，万丽，王峥涛.一测多评法测定川白芷药材中3种香豆素成分的含量［J］.中国中药杂志，2012，37(7):956-960.

［10］王瑞，黄山君，谢培山，等.一测多评法测定赤芍中不同类型成分的含量［J］.沈阳药科大学学报，2011，28(8):594-598.

［11］李博岩，梁逸曾，谢培山，等.光谱相关色谱及在中药色谱指纹图谱分析中的应用［J］.分析化学，2003，31(7):799-803.

［12］李博岩，梁逸曾，胡芸，等.中药色谱指纹图谱组分保留时间漂移的校准［J］.分析化学，2004，32(3):313-316.