HPLC法同时测定麦味地黄胶囊中马钱苷、芍药苷和丹皮酚

2012-01-26冯发青王恩源伍庆龙风荣柳立伟洪江

中成药 2012年12期

冯发青，王恩源，伍庆，龙风荣，柳立伟，洪江

(1.贵州师范大学，贵州贵阳550001;2.贵州弘康药业有限公司，贵州贵阳550001;3.贵州科学院，贵州贵阳550001)

麦味地黄胶囊处方出自明代经典医籍《体仁汇编》，是在麦味地黄丸基础上进行改剂而成。其方中山茱萸具有补益肝肾，涩精固脱之功效，马钱苷为其主要有效成分之一，牡丹皮具有清热凉血，活血化瘀的功效，主要有效成分为丹皮酚和芍药苷［1］。《中国药典》2010年版一部以马钱苷和丹皮酚为麦味地黄丸的质量控制指标［2］，前人也对此类中成药中马钱苷或丹皮酚的含有量测定方法进行了研究［3-7］，但对方中芍药苷含有量测定方法研究较少。本实验选择马钱苷、芍药苷、丹皮酚为研究对象，在参照文献基础上［8-13］，建立了一种同时测定麦味地黄胶囊中马钱苷、芍药苷和丹皮酚的方法，该方法准确可靠，为更好地控制麦味地黄胶囊成品质量提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器Agilent 1200高效液相色谱仪、Agilent色谱工作站(安捷伦科技有限公司);CH—250超声波清洗仪(北京创新德超声电子研究所);AL—204电子天平［梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司］。

1.2 试药马钱苷对照品(批号111640-200604)、芍药苷对照品(批号110736-200629);丹皮酚对照品(批号110708-200506)为中国药品生物制品检定所提供;麦味地黄胶囊为市售(批号:20111101，20111201，20111202，贵州弘康药业有限公司);缺山茱萸、牡丹皮阴性样品(自制);乙腈为色谱纯，水为超纯水(自制)，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～28 min，8%A～19%A;28～38 min，19%A～26%A;38～65 min，26%A～50%A);体积流量:1.0 mL/min;柱温:30℃;检测波长:235 nm。进样量:10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备分别精密称取马钱苷、芍药苷和丹皮酚对照品适量，加甲醇适量溶解并定量稀释制成含马钱苷0.522 1 mg/mL、芍药苷0.453 8 mg/mL和丹皮酚1.029 mg/mL的混合对照品贮备液，备用。精密吸取上述贮备液1 mL于10 mL量瓶中，甲醇定容，制得含马钱苷52.21 μg/mL、芍药苷45.38 μg/mL和丹皮酚0.102 9 mg/mL的混合对照品溶液。供定量测定用。

2.2.2 供试品溶液的制备取麦味地黄胶囊内容物约1.0 g，精密称定，至具塞锥形瓶中，加50%甲醇20.00 mL，密塞，称定质量;超声提取1 h，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，常压过滤，取续滤液过0.45 μm滤膜，即得。

2.2.3 阴性供试品溶液的制备按处方比例分别制备缺山茱萸、牡丹皮药材的阴性样品，按2.2.2项下方法制备阴性供试品溶液。

2.3 系统适应性试验精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液分别注入高效液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进样，记录色谱图，结果马钱苷、芍药苷和丹皮酚的理论塔板数均不低于10 000，各峰分离度均达1.5，且阴性对照无干扰。对照品、样品与阴性样品的色谱图见图1。

图1 对照品(A)、样品(B)、缺牡丹皮阴性样品(C)、缺山茱萸阴性样品(D)高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s of reference substances(A)，sam ple(B)，negative samp le w ithout Corni Fructus(C)and negative samp le w ithout Moutan Cortex(D)

2.4 线性关系的考察分别精密量取上述混合对照品贮备液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液。按2.1项下色谱条件分别进样10 μL，记录色谱图。以各对照品峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X，μg)为横坐标进行线性回归，得回归方程分别为:马钱苷Y=1 254.3X+49.359(r=0.999 8)，芍药苷Y=1 585.7X+17.172(r=0.999 7)，丹皮酚Y=3 447.2X－73.445(r=0.999 9)，结果表明马钱苷在0.209～1.253 μg，芍药苷在0.182～1.089 μg，丹皮酚在0.412～2.470 μg范围内，其含有量与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验精密吸取同一混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件重复进样6次，按峰面积计算RSD值。马钱苷、芍药苷和丹皮酚的RSD分别为0.4%、0.5%和0.3%，结果表明，仪器精密度良好。2.6稳定性试验取批号为20111201样品，按2.2.2项下制备供试品溶液，室温放置，按2.1项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、10 h进样测定，记录色谱峰面积，结果马钱苷、芍药苷和丹皮酚峰面积RSD分别为0.2%、1.1%和0.3%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.7 重复性试验取批号为20111201样品，按2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，计算得马钱苷、芍药苷和丹皮酚质量分数的RSD分别为1.1%、1.2%和0.5%，表明该方法重复性好。

2.8 回收率试验取批号为20111201麦味地黄胶囊内容物9份(3份1组)，每份约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，各组分别按样品中各成分量的80%、100%、120%加入对照品，按2.2.2项下的方法操作制备供试品溶液，按2.1项下方法进行测定，计算回收率。结果马钱苷、芍药苷、丹皮酚的平均回收率分别为98.22%、97.88%、99.10%，RSD分别为1.14%、0.90%、1.37%，见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=9)Tab.1 Results of recovery(n=9)

2.9 样品测定取3批样品(批号20111101、20111201、20111202)，每批3份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件对3批样品进行测定，记录峰面积，外标法计算，测定结果见表2。

表2 样品测定结果(n=3)Tab.2 Content determ ination of samp les(n=3)

3 讨论

3.1 检测波长的选择经紫外可见分光光度计扫描，马钱苷在235 nm处有最大吸收峰，芍药苷在230 nm处有最大吸收峰，丹皮酚在230 nm、274 nm处均有吸收峰。通过实验考察在波长为235 nm时马钱苷、芍药苷和丹皮酚均有较好的响应，所以本实验选择检测波长为235 nm。

3.2 流动相的选择《中国药典》2010年版一部中麦味地黄丸有关马钱苷的测定以含有四氢呋喃为流动相，而四氢呋喃对反相色谱系统的柱塞密封圈有一定的腐蚀性，故本实验考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液等流动相体系。发现以乙腈-0.1%磷酸水溶液流动相体系中进行梯度洗脱时，其分离度、理论塔板数、峰的对称性及出峰时间均达到满意的结果，且可与芍药苷、丹皮酚在同一流动相体系中进行同时测定。

3.3 提取溶剂和方法的选择由于芍药苷、马钱苷易溶于水，丹皮酚易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，故实验比较了甲醇，乙醇，及80%、50%、20%甲醇5种提取溶剂，并考察了超声和加热回流两种提取方法，以及提取时间和溶剂体积等，试验结果表明加入20 mL 50%甲醇溶液超声提取1 h的条件下各指标成分提取完全、方法简便，提取效果较好。

3.4 结论通过提取条件的优化、色谱条件的选择及系统性试验的考察，说明该方法快速，结果准确可靠，可以为提高麦味地黄胶囊的质量控制提供依据。

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