高效液相色谱-双波长紫外检测同时测定清肺抑火片中4种药效成分

马志英

(西北民族大学化工学院，甘肃兰州730030)

清肺抑火片由黄芩、栀子、黄柏、大黄、苦参、天花粉、知母、桔梗、前胡组成，具有清肺止嗽，降火生津功能，主治肺热咳嗽，痰延壅盛，咽喉肿痛，口鼻生疮，牙齿疼痛，牙根出血，大便干燥，小便赤黄［1］。其中黄芩苷、栀子苷、小檗碱及大黄素量高低直接影响清肺抑火片的药效［2-7］。

虽有HPLC法测定清肺抑火片中大黄素、栀子苷或黄芩苷成分的报道［8-9］，但同时测定其栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱及大黄素的方法尚未见报道。本实验建立了HPLC双波长紫外检测同时测定清肺抑火片中栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱及大黄素4种有效成分的方法。结果表明，该方法快速、准确，重复性和精密度均良好，适用于同时测定清肺抑火片中栀子苷、黄芩苷、小檗碱及大黄素4种成分，为清肺抑火片的质量控制和评价提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器Agilent 1200高效液相色谱仪(配置真空脱气机G1322A、四元泵G1311A、自动进样器G1329A、二级管阵列检测器DAD，G1315B);ZORBX Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，美国安捷伦公司产品;AS3120型超声波清洗器，天津奥特赛恩斯仪器有限公司产品;梅特勒AB204-S标准型分析天平，瑞士梅特勒公司产品。

1.2 试药栀子苷对照品(批号:110749-20010)、黄芩苷对照品(批号:110715-201016)、盐酸小檗碱对照品(批号:110713-200609)和大黄素对照品(批号:110756-200110)均购于中国药品生物制品检定所;清肺抑火片(修正药业集团股份有限公司，规格:0.6 g/片，批号:091107，100618，101156);乙腈为色谱纯;甲醇、磷酸为分析纯;水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件和系统适用性试验色谱柱:E-clipse XDB-C18键合硅胶柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);柱温:30℃;波长:240 nm(栀子苷)，278nm(黄芩苷，盐酸小檗碱，大黄素);体积流量1.00 mL/min。;进样量:10 μL;流动相:乙腈-0.2%磷酸水溶液(体积比)，梯度洗脱程序见表1。理论板数按黄芩苷计算不低于5 000。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 M obile phase elution procedure

2.2 实验溶液的制备

2.2.1 对照品溶液精密称取栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、大黄素对照品各适量，分别置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇适量并超声30 min溶解，放冷至室温，用甲醇定容，制得质量浓度分别为0.460 0 mg/mL、0.930 0 mg/mL、0.430 0 mg/mL、0.360 0 mg/mL的栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、大黄素对照品贮备液。精密吸取上述4种对照品贮备液各适量，置同一10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容、摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得含栀子苷0.036 8 mg/mL、黄芩苷0.074 4 mg/mL、盐酸小檗碱0.038 7 mg/mL、大黄素0.057 6 mg/mL的对照品混合溶液。

2.2.2 样品溶液取样品15片，置研钵中研细混合均匀，精密称定约0.2 g，置具塞三角烧瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声溶解30 min，放冷至室温，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3 阴性对照溶液依照清肺抑火片的处方比例和生产工艺，取缺栀子、黄芩、黄柏、大黄的阴性样品，按2.2.2项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 专属性试验分别精密吸取2.2.1项下对照品混合溶液、2.2.2项下供试品溶液、2.2.3项下阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图。结果，在此条件下供试品中栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、大黄素色谱峰与他们各自相邻色谱峰的分离度不低于1.6，理论塔板数以黄芩苷计不低于5 000，阴性对照溶液在对照品相应保留时间未出现色谱峰，表明本法专属性强。色谱图见图1、图2。

图1 双检测波长下4成分混合对照品溶液的色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s of standards solution at dual detection wavelengths

图2 双检测波长下供试品和阴性对照品溶液的色谱图Fig.2 HPLC chromatogram s of samp le solutions and negative control solutions at the dual detection wavelengths

2.4 方法的线性范围精密吸取2.2.1项下对照品混合溶液0.5、1、2、3、5、7、9、10 mL，分别置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得系列混合标准溶液。分别进样10 μL，按2.1项下色谱条件测定，以对照品进样量(μg)为横坐标(X)，色谱峰面积积分值为纵坐标(Y)进行线性回归分析，得栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素的回归方程分别为Y=1 535.5X+1.115 3(r=0.9998)、Y=2 909.3X+7.017 6(r=0.999 8)、Y=1 315.1X+3.442 9(r=0.999 9)、和Y=2 028.1X－32.383，(r=0.999 8)，线性范围分别为0.036 8～0.331μg、0.074 4～0.670μg、0.038 7～0.348 μg和0.057 6～0.518 μg。结果表明，栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱与大黄素4种组分的进样量与其峰面积积分值线性关系良好。

2.5 方法的最低检测限取混合对照品溶液逐步稀释后，注入高效液相色谱仪，以峰高为基线噪音3倍计，栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、大黄素的最低检测限质量浓度分别是2.8 ng/mL、5.3 ng/mL、2.5 ng/mL、3.6 ng/mL。

2.6 仪器精密度精密吸取2.2.1项下对照品混合溶液10 μL，按2.1项下色谱条件进样测定，重复测定6次，记录色谱图，结果，栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、大黄素峰面积的RSD分别为:0.63%、0.76%、0.46%、0.83%。可见仪器精密度良好。

2.7 溶液稳定性分别精密吸取同一批号(批号:100618)的供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h，按2.1项下色谱条件测定，进样量10 μL，记录色谱图，结果，12 h内栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素的RSD分别为1.11%、1.88%、1.49%、1.53%，表明供试品溶液在室温放置12 h内稳定(n=6)。

2.8 方法重复性取同一批样品(091107)共6份，分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，进样量10 μL，记录色谱图，结果样品中栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素平均质量分数分别为3.446 mg/g、7.654 mg/g、1.436 mg/g、1.750 mg/g，RSD分别为0.906%、1.24%，1.12%、1.23%，表明方法重复性良好(n=6)。

2.9 方法回收率精密称取已测定的样品(批号:100618)共9份，每份约0.1 g，精密称定，按照供试品中有效成分栀子苷、黄芩苷盐、盐酸小檗碱、大黄素量高、中、低(即80%、100%、120%)比例分别精密加入对照品贮备液适量，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定样品，计算加样回收率。结果分别见表2～5。

2.10 实际样品的测定分别取3批样品，按2.2.2项下的方法制备供试品溶液，依2.1项下色谱条件测定含量，结果见表6。3批样品中，批号为101156的样品含量与批号为091107、100618有明显的差异。

表2 栀子苷加样回收率试验结果(n=9)Tab.2 Recovery results of geniposide(n=9)

表3 黄芩苷加样回收率试验结果(n=9)Tab.3 Recovery results of baicalin(n=9)

表4 盐酸小檗碱加样回收率试验结果(n=9)Tab.4 Recovery resu lts of berberine hyd rochloride(n=9)

表5 大黄素加样回收率试验结果(n=9)Tab.5 Recovery results of em odin(n=9)

表6 样品测定结果(n=3)Tab.6 Contents of four com ponents in Qingfei Yihuo Tablets(n=3)

3 讨论

3.1 本实验根据文献［10］，以95%乙醇做提取剂，采用超声波法比较了20～60 min样品成分的效果，发现超声时间少于30 min，栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素的量明显少。而30～50 min的栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱和大黄素的量差异不明显，故本实验选择超声提取时间为30 min。

3.2 高效液相色谱法与二极管阵列检测器联用，可在紫外－可见波长范围内对被分离组分扫描获得其吸收光谱。本实验应用二极管阵列检测器对栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、大黄素溶液在200～400 nm进行光谱扫描显示，栀子苷在240、254 nm，黄芩苷在278、320 nm，盐酸小檗碱在230、265、347 nm，大黄素在230、290 nm处有最大吸收，比较发现栀子苷在278 nm吸收很小，在240 nm处基线分离无干扰，响应值高、峰形对称且尖锐，黄芩苷、盐酸小檗碱、大黄素在278 nm处吸收响应值均较高，阴性试验无干扰，故为有效保证各组分的检测灵敏度，本实验在240 nm波长测定栀子苷，278 nm波长测定黄芩苷、盐酸小檗碱、大黄素4种成分。

3.3 根据文献［11-12］，经试验最终以乙腈-0.2%磷酸为流动相进行分析测定，样品中待测峰的峰形对称且尖锐，各峰基线能彻底分离，栀子苷、黄芩苷、盐酸小檗碱、大黄素保留时间适中。

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