丹皮酚对同型半胱氨酸损伤内皮细胞eNOS表达及NO水平的影响

徐倩，曹凯，周晓慧，王小杰，王一帆，杜超

(承德医学院，河北承德067000)

动脉粥样硬化(atherosclerosis)是当今社会发病率最高、危害最大的疾病之一［1］，它是多种心脑血管事件的病理基础，可诱发多种中老年常见病［2］。动脉粥样硬化的病理机制十分复杂，其中心环节是血管内皮的损伤，内皮形态结构改变和功能受损是动脉粥样硬化发生发展的始动因素之一［3］。高同型半胱氨酸血症是动脉粥样硬化的独立危险因素之一［4］，可损伤内皮细胞从而启动动脉粥样硬化。一氧化氮(nitric oxide，NO)是检测血管内皮功能的重要的血清指标之一。

丹皮酚(paeonol)作为传统的中药有效成分，具有广泛的药理活性，其中在心血管方面有抗动脉粥样硬化，抗血栓，抗心律失常等作用［5］。本研究以同型半胱氨酸为损伤因子建立内皮细胞损伤模型，通过观察内皮细胞形态学变化，检测细胞活力、一氧化氮合酶(eNOS)的表达及细胞培养液中NO水平，观察丹皮酚对人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Veins Endothelial Cells，HUVECs)的保护作用，并探讨其分子机制，为临床应用丹皮酚防治动脉粥样硬化提供有价值的实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂DMEM培养基购于Gibco公司，胎牛血清购自CLACK公司。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)购于Pepro Tech公司。同型半胱氨酸购于Sigma公司。丹皮酚注射液(5 mg/mL，批号为20110603)购于宁波天真制药有限公司。TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0购于大连宝生物工程有限公司，DEPC购于amresco公司，Trizol购于invitrogen公司，DNA Maker购于BIO BASIC INC公司。eNOS引物、β-actin引物由上海生物工程有限公司设计。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器HERAcell 150型CO2孵育箱(Heraeus公司);LEICA DMIL 090-135.001型倒置显微镜(Wetzlar GmbH公司);Multiskan MK3酶联仪(Thermo公司);DU800型紫外可见分光光度计(BECKMAN COULTER公司);ZF型紫外透射反射分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)。

1.3 HUVECs培养及分组于承德医学院附属医院取健康剖腹产妇新生胎儿脐带，在无菌操作台内剪去脐带夹痕及血肿处，用D-Hanks液将脐带冲洗干净，用1∶1的0.1%Ⅰ型胶原酶、0.25%的胰酶－0.02%EDTA(V/V=1∶1)消化13 min，收集消化液，然后用D-Hanks液冲洗管腔2次，将消化液与冲洗液一并收集于离心管中。1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入含20%胎牛血清、10 μg/L bFGF的DMEM培养基，用吸管吹打均匀后，接种于25 cm2培养瓶中，置于5%CO2、37℃培养箱中培养。培养24 h后换液，以后每2 d换1次液。待细胞达到80%～90%融合时，用0.125%胰酶－0.01%EDTA(V/V=1∶1)消化传代。实验用第2代细胞，实验分为5组:正常对照组、同型半胱氨酸损伤模型组(同型半胱氨酸10 mmol/L组)、丹皮酚低剂量组(同型半胱氨酸10 mmol/L+0.15 mmol/L丹皮酚)、丹皮酚中剂量组(同型半胱氨酸10 mmol/L+0.3 mmol/L丹皮酚)、丹皮酚高剂量组(同型半胱氨酸10 mmol/L+0.6 mmol/L丹皮酚)。上述各分组细胞加含20%胎牛血清、10 μg/L bFGF的DMEM培养基。各分组细胞继续培养48 h。

1.4 细胞形态观察倒置显微镜(×40)观察各组HUVECs细胞形态学变化。

1.5 MTT法检测细胞活力当原代细胞达到80%～90%融合时，用体积比为1∶1的0.125%胰酶－0.01%EDTA消化，以1.0×108个/L细胞悬液的密度，接种于96孔板，每孔200 μL。待细胞达到80%～90%融合时，弃去原培养液，每孔加入200 μL不含血清的DMEM培养基，使细胞同步化。24 h后，按实验分组施加干预。每组设6个复孔，同时设置空白对照(只有培养液，无细胞)。培养48 h后，每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL，继续培养4 h，吸弃上清，每孔再加入二甲基亚砜150 μL。充分振荡，待甲臜结晶全部溶解后，用酶联仪测定在波长490 nm处各孔的吸光度值。

1.6 RT-PCR法检测各组HUVECs中eNOS mRNA的表达将第2代HUVECs细胞以1.5×108个/L的密度接种于6孔培养板中。提取RNA时，每孔加入Trizol 1 mL，按一步法提取各组细胞总RNA。按TaKaRa RNA PCR试剂盒进行逆转录反应，逆转录成cDNA，再扩增成DNA。eNOS扩增条件为:94℃预变性2 min，94℃变性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸1 min，扩增35个循环。最后10℃延伸20 min。内参照β-actin扩增条件为:94℃预变性2 min，94℃变性30s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，扩增35个循环。最后10℃延伸20 min。eNOS上游序列为:5’CCAGCATCCCTACTCCCACCAG3’，下游序列为:5’CACCTCGGCTTCCACCTCTTG3’。扩增片段为348 bp。β-actin上游序列为:5’AGCGGGAAATCGTGCGTGAC3’，下游序列为:5’ACATCTGCTGGAAGGTGGAC3’。扩增片段为453 bp。取5 μL PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳，用紫外透射仪拍摄图象。用Quantity One软件进行定量分析，eNOS mRNA相对表达强度=eNOS mRNA扫描值/β-actin mRNA扫描值。实验重复5次。

1.7 硝酸还原酶法检测各组HUVECs培养液中NO水平吸取6孔培养板中的细胞培养液，按南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行测定，通过显色深浅即吸光度的不同测定NO水平的高低。结果按下列公式计算:

×标准品浓度(100 μmol/L)×样品测试前稀释倍数。1.8统计学处理运用SPSS 11.5进行统计学分析，多组间计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 倒置显微镜观察各组HUVECs细胞形态学变化与正常对照组比较，同型半胱氨酸损伤模型组细胞呈团簇状，轮廓不清，有较多细胞脱落。丹皮酚各剂量组的细胞数量较多，细胞间隙逐渐变窄，形态趋于正常。

2.2 不同浓度丹皮酚对同型半胱氨酸损伤HUVECs细胞活力的影响同型半胱氨酸损伤模型组细胞活力最低(P＜0.01)，随着丹皮酚浓度由低到高，丹皮酚各剂量组细胞活力也明显升高(P＜0.05)。见表1。说明此剂量的同型半胱氨酸可使内皮细胞受到损伤，活性下降，而不同浓度的丹皮酚可以明显抑制同型半胱氨酸的损伤作用。

表1 丹皮酚对同型半胱氨酸损伤HUVECs细胞活力的影响(±s，n=5)Tab.1 Effect of paeonol on the cell viability in HUVECs induced by homocysteine in each group by the method of MTT(±s，n=5)

表1 丹皮酚对同型半胱氨酸损伤HUVECs细胞活力的影响(±s，n=5)Tab.1 Effect of paeonol on the cell viability in HUVECs induced by homocysteine in each group by the method of MTT(±s，n=5)

注:与正常对照组比较，△P＜0.01;与同型半胱氨酸损伤模型组比较，*P＜0.05。

组别丹皮酚/(mmol·L－1)A 值正常对照组同型半胱氨酸损伤模型组丹皮酚低剂量组丹皮酚中剂量组丹皮酚高剂量组－－0.15 0.3 0.6 0.537 7±0.016 7 0.256 0±0.030 6△0.305 2±0.033 1*0.450 0±0.020 3*0.508 8±0.024 5*

2.3 不同浓度丹皮酚对同型半胱氨酸损伤HUVECs eNOS mRNA表达的影响同型半胱氨酸损伤模型组eNOS mRNA的表达明显降低(P＜0.01)，而丹皮酚各剂量组的eNOS mRNA表达明显增强(P＜0.01)，并呈现一定的剂量依赖性(P＜0.05)。表明丹皮酚能阻断丹皮酚下调eNOS mRNA的表达，且具有一定的剂量依赖性。见表2，图1。

表2 丹皮酚对同型半胱氨酸损伤HUVECs eNOS m RNA表达的影响(±s，n=5)Tab.2 Effect of paeonol on the expression of eNOS m RNA in HUVECs induced by homocysteine in each group(±s，n=5)

表2 丹皮酚对同型半胱氨酸损伤HUVECs eNOS m RNA表达的影响(±s，n=5)Tab.2 Effect of paeonol on the expression of eNOS m RNA in HUVECs induced by homocysteine in each group(±s，n=5)

注:与正常对照组比较，△P＜0.01;与同型半胱氨酸损伤模型组比较，*P＜0.01。

组别丹皮酚/(mmol·L－1)eNOS/β-actin正常对照组－0.521 8±0.020 2同型半胱氨酸损伤模型组－0.166 7±0.015 3△丹皮酚低剂量组0.15 0.253 3±0.025 2*丹皮酚中剂量组0.3 0.355 9±0.013 2*丹皮酚高剂量组0.6 0.413 3±0.015 3*

2.4 不同浓度丹皮酚对同型半胱氨酸损伤HUVECs培养液中NO水平的影响与正常对照组比较，同型半胱氨酸损伤模型组HUVECs培养液中NO水平明显降低(P＜0.01)。而加入丹皮酚后，随着丹皮酚浓度的增加，HUVECs培养液中NO水平也逐渐升高，与同型半胱氨酸损伤模型组比较，丹皮酚各剂量组NO水平明显升高(P＜0.05)。见表3。

3 讨论

图1 丹皮酚对同型半胱氨酸损伤HUVECs eNOS mRNA表达的影响Fig.1 Effect of paeonol on the expression of eNOS mRNA in HUVECs induced by homocysteine in each group(±s，n=5)

表3 丹皮酚对同型半胱氨酸损伤HUVECs培养液中NO水平的影响(±s，n=5)Tab.3 Effect of paeonol on the content of NO in the cultured supernate of HUVECs induced by homocysteine in each group(±s，n=5)

表3 丹皮酚对同型半胱氨酸损伤HUVECs培养液中NO水平的影响(±s，n=5)Tab.3 Effect of paeonol on the content of NO in the cultured supernate of HUVECs induced by homocysteine in each group(±s，n=5)

注:与正常对照组比较，△P＜0.01;与同型半胱氨酸损伤模型组比较，*P＜0.05。

组别丹皮酚/(mmol·L－1)NO/(μmoL·L－1)正常对照组－174.137 9±3.216 5同型半胱氨酸损伤模型组－84.356 3±6.054 9△丹皮酚低剂量组0.15 113.793 1±4.561 6*丹皮酚中剂量组0.3 141.954 0±4.338 9*丹皮酚高剂量组0.6 158.046 5±5.217 7*

大量研究表明高同型半胱氨酸血症是导致动脉粥样硬化的的独立危险因素之一。同型半胱氨酸是非蛋白构成型含硫的非必需氨基酸，是蛋氨酸代谢过程中一个重要的中间产物［6］。同型半胱氨酸在血管内皮细胞内过分蓄积时，有直接损伤内皮细胞的作用。而内皮损伤是导致动脉粥样硬化的始动因素之一。丹皮酚亦称牡丹酚，是中药牡丹皮(芍药科植物牡丹根皮)和徐长卿(萝摩科植物徐长卿的全草)的主要活性成分，具有抗动脉硬化，抗心律失常等作用［7］。

本研究采用同型半胱氨酸诱导HUVECs损伤的模型。研究结果显示，同型半胱氨酸损伤模型组，细胞活力明显下降，在倒置相差显微镜下观察，可见细胞呈团簇状，轮廓不清，出现片状分离，脱落现象。丹皮酚干预后，随着丹皮酚浓度的升高，同型半胱氨酸损伤的细胞活力显著提高，细胞间隙逐渐变窄，形态趋于正常。表明丹皮酚对同型半胱氨酸损伤的内皮细胞有直接的保护作用。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是检测内皮功能的重要的指标，最初被称为内皮衍生舒张因子，可舒张血管，抑制缩血管物质的分泌，抑制血管平滑肌细胞迁移、增殖和血小板聚集，抑制单核-巨噬细胞与内皮细胞黏附等［8］，因此被称为“内源性抗动脉粥样硬化因子”。NO水平与生物活性的变化反映内皮功能的状态，NO功能低下与内皮细胞的损伤过程密切相关［9］。

在人体内一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸的胍基氮氧化生成NO。在血管调节功能中起决定作用的是内皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)，它是NOS的一种亚型［10］。人eNOS基因位于7号染色体，共21 kb，包含26个外显子和25个内含子［11］。eNOS的表达水平是NO生成的决定因素，eNOS的功能降低或合成减少，会导致NO减少，不能维持正常的内皮细胞功能，从而诱发动脉粥样硬化［12］。

本研究结果显示，与正常对照组比较，同型半胱氨酸损伤模型组eNOS mRNA的表达显著下降，其细胞培养液中NO水平也明显降低;与模型组比较，丹皮酚低、中、高剂量组，eNOS mRNA表达明显增强，且呈现一定的剂量依赖性，细胞培养液中NO水平明显升高。

综上所述，丹皮酚对同型半胱氨酸损伤的HUVECs具有保护作用，从细胞水平证实丹皮酚具有抗同型半胱氨酸诱导的动脉粥样硬化的作用。其分子机制可能为丹皮酚促进eNOS的基因表达，增加其活性，提高内皮细胞生成的NO水平，从而对血管内皮功能损伤有保护作用，进而对动脉粥样硬化的发生、发展有积极的防御作用。

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