双葛解酲丸对酒精性脂肪肝大鼠的保护作用

魏文茂，朱丽丽，罗华丽，蒲晓东(1.重庆医科大学中医药学院，重庆400016)

近年来随着经济的快速发展和人们生活水平的不断提高，人均消耗酒精量也在不断的增加，酒精性脂肪肝病在我国发病率不断攀升，是临床上最常见、最早期的酒精性肝病(alcoholic liver disease)之一，乙醇会严重损伤肝脏功能，80%以上重度饮酒者都有不同程度脂肪肝产生［1］。现在医学对其治疗效果不明显，也还没有特异性的治疗方法，而且副作用比较明显［2－3］。但传统医学通过辨证论治治疗对酒精性脂肪肝有其独特的疗效。双葛解酲丸是一种新研制的经过临床检验效果显著的中药复方药剂，本实验通过酒精灌胃建立酒精性脂肪肝的大鼠模型，通过检测血清谷胱甘肽－过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH－PX)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)的表达水平，来研究双葛解酲丸减轻酒精性脂肪肝大鼠肝脏的脂肪变性和炎症介质浸润的损伤和保护肝脏的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁级SD大鼠65只，体质量(175±25)g，雄性32只，雌性33只，购买于重庆医科大学实验动物中心，喂养于重庆医科大学实验动物中心SPF级实验室。

1.2 主要试剂及器材海王金樽片购买于桐君阁大药房(1.0 g/片，深圳市海王健康发展有限公司，产品批号20101025);56°红星二锅头购买于重庆百货商场(北京酿造总厂2009年生产);双葛解酲丸汤剂(重庆市桐君阁大药房提供，由重庆医科大学中药实验室熬药制备成1 g生药/mL的浓缩液);SOD试剂盒(批号20110613);MDA试剂盒(批号20110620);GSH－PX(批号20110623)(均由南京建成生物工程研究所提供);赛多利斯BS110S电子秤(德国赛多利斯股份公司);UNICO7200分光光度计(北京谷美特科技有限公司);80－2型低速离心机(金坛市天瑞仪器配件厂);100°水浴箱(北京艾飞博科技有限公司);HH－4恒温水浴箱(江苏省金坛市友联仪器研究所)。

1.3 建立酒精性脂肪肝模型大鼠65只，随机分成2组，酒精性脂肪肝组(54只)，每日喂养普通饲料，并以56°白酒10 mL/kg灌胃2次，上下午各1次，连续灌胃8周。空白对照组11只，每日喂养普通饲料并灌胃10 mL蒸馏水，上下午各1次，连续灌胃8周。8周后，取酒精性脂肪肝组4只大鼠与空白对照组1只大鼠处死后，取肝脏进行病理切片对比后证实脂肪肝已形成，继而停止造模，进行药物治疗。将50只酒精性脂肪肝组大鼠随机分模型对照组、双葛解酲丸低剂量组、双葛解酲丸中剂量、双葛解酲丸高剂量组和海王金樽组5个组别，低剂量组灌胃双葛解酲丸5 g/(kg·d)，中剂量组灌胃双葛解酲丸10 g/(kg·d)，高剂量组灌胃双葛解酲丸20 g/(kg·d)，海王金樽组灌胃海王金樽片1.5 g/kg灌胃，分别每日灌胃2次，上下午各1次，空白对照组以10 mL蒸馏水灌胃持续4周。

1.4 标本采集实验的12周末，大鼠禁食24 h后称质量，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，然后经心脏穿刺采血快速取出肝脏，每只均于肝左叶取材3块，用于病理切片。采集血液于清洁塑料离心管中静置后，并在低温离心机上3 000 r/min离心15 min，常规收集血清置于－80°冰箱保存待测。

1.5 检测项目和方法观察身体特征:大鼠的活动情况及精神状态，肝脏质量、外观、色泽、形状、质地以及皮毛光泽程度。

肝指数:称其体和肝的质量，计算出肝/体质量的比值，为其肝指数。

GSH－PX，MDA，SOD，FFA的测定:采用比色法对其血清测定上述指标，测定步骤严格按照GSH－PX，MDA，SOD，FFA试剂盒说明书进行。

病理学检测:取肝脏左叶同样部位的大小质量一致的两块肝组织放入10%的甲醛中固定存放，并进行常规的石蜡包埋、HE染色、切片和光镜下观察拍照。

1.6 统计分析统计学处理采用SPSS 13.0软件，数据结果用均数±标准差(±s)表示，组与组之间比较采用单因素方差分析中的SNK法进行分析统计。

2 结果

2.1 双葛解酲丸对肝指数和体质量的影响实验期间，除空白对照组大鼠以外，各组大鼠体质量都有不同程度的降低，模型对照组与空白对照组比较，下降较为明显，治疗组体质量相比模型对照组都有不同程度的增加。见表1。

表1 双葛解酲丸对肝指数和体质量的影响Tab.1 Effects of Shuangge Jiecheng Pills on im provem ent of rat’s liver-index and weight in each group

2.2 肝组织病理改变在实验过程中，模型对照组大鼠皮毛发黄光泽度差、体质量明显减轻，空白对照组大鼠皮毛光滑光泽度高，精神充沛。肉眼观察模型对照组大鼠肝脏体积增大，颜色发黄白，边缘变钝，切面有油腻感，光镜下可见空白对照组大鼠肝小叶结构正常完整无形态学改变，肝细胞排列紧密成索状，无变性坏死的炎症细胞浸润及肝细胞脂肪样变性，仅在细胞间质中有少量脂滴，但其模型对照组大量肝细胞肿胀，胞浆内有中大泡型的脂滴产生，肝细胞也有中度至重度的脂肪变性，并伴有炎症细胞的浸润，经过药物治疗后，双葛解酲丸高剂量组肝细胞脂肪样变性和炎症介质的浸润较模型对照组明显减轻。双葛解酲丸低剂量组、双葛解酲丸中剂量组、海王金樽组也有不同程度的减轻，见图1。按表2标准，光镜检查脂变程度。光镜下检查结果见表3。

图1 HE染色肝细胞病理变化Fig.1 Photos of HE staining show ing the changes of the liver cells in alcoholic fatty liver disease rats in each group

表2 肝脂变程度分级标准Tab.2 Classification standard of liver steatosis degree

表3 对综合因素致大鼠脂肪肝模型的预防作用肝脏病理光镜检查结果Tab.3 Light m icroscopic exam ination results of preventive effects on liver pathology of fatty liver rat model induced by comprehensive factors

2.3 双葛解酲丸对大鼠血清MDA，SOD，GSH－PX的影响由表4～5可见，模型对照组大鼠血清MDA显著高于正常组，GSH－PX和SOD显著低于正常组(P＜0.01)，双葛治疗组大鼠血清MDA明显低于模型对照组(P＜0.05)，GSH－PX和SOD显著高于模型对照组(P＜0.05)。

表4 双葛解酲丸对大鼠血清MDA、SOD的影响Tab.4 Effects of Shuangge Jiecheng Pills on improvement of rats’serum-MDA and serum-SOD in each group

表5 双葛解酲丸对大鼠血清GSH-PX、FFA的影响Tab.5 Shuangge Jiecheng Pills on im provement of rats’serum-GSH-PX and serum-FFA in each group

3 讨论

关于酒精性脂肪肝的发病机理目前尚不清楚，近年来很多学者提出以氧化应激和脂质过氧化为核心的“二次打击”假说［5］，氧化应激与脂质过氧化在酒精性脂肪肝的形成与发展中起到了重要作用［6－7］。

游离脂肪酸被认为是酒精性脂肪肝的重要的起始因子，是酒精性脂肪肝发生的关键性因素。游离脂肪酸可以直接损伤细胞质、肝线粒体及溶酶体膜，导致肝细胞变性、坏死和炎性介子的浸润，线粒体肿胀和通透性加大。研究还认为升高的FFA还减少胰岛素消除并损害肝细胞对胰岛素敏感性，加重胰岛素抵抗，FFA增多与细胞色素P450ⅡE1的高表达及脂质过氧化反应增强有一定的联系［8］。另外增加游离脂肪酸还可以导致胰岛素血症的产生，血中胰岛素又促使脂肪的合成，抑制其分解，进一步导致血脂的升高、肝细胞内脂肪沉积及肝细胞肿大，导致脂肪肝的形成。

本实验检测了酒精性脂肪肝大鼠的血清SOD、GSH－PX活力和MDA，FFA含有量，模型对照组大鼠的MDA和FFA较正常组大鼠显著升高，SOD、GSH－PX较正常组显著降低，表明大量酒精摄入大鼠体内，导致自由基在体内不断的堆积，过量自由基与生物膜中不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，产生大量的MDA，从而破坏生物膜的正常功能和结构，造成肝损伤。实验结果表明双葛解酲丸组和海王金樽组大鼠的血清SOD含有量和GSH－PX明显高于模型对照组(P＜0.05)，MDA和FFA含有量明显低于模型对照组(P＜0.05)，而双葛解酲组的效果明显好于海王金樽组。由此可见双葛解酲丸可以明显提高血清SOD和GSH－PX活力并减低血清中MDA和FFA，清除机体代谢产生的自由基，促使氧化与抗氧化机制恢复正常，消除炎症反应，阻断自由基的放大效应，使肝功和肝组织的病理学形态恢复正常，对酒精性脂肪肝具有良好的防治效果。

在祖国的古代医籍中没有提出酒精性脂肪肝的概念，结合其病因和病机的特点，现代学者一般将其归于“酒疳”、“酒癖”等范畴。赵文霞等［9］指出，酒精性脂肪肝病机为本虚而标实，本虚在脾、肾、肝虚，标实在痰、瘀阻、湿等病理产物为主要病理因素。双葛解酲丸以健脾化湿，发汗利水，疏肝理气为组方原则，以葛花、枳椇子、葛根为其主药，其中葛花其水提取通过增强乙醇脱氢酶活性来降低血液中乙醇，在乙醇的肠胃代谢与吸收两个方面发挥重要作用，对酒精引起的肝细胞损伤变性有保护作用［10］，葛花是具有很好的透解之力，解酒醒神之佳品，研究表明口服葛花以及静脉注射尼泊尔莺尾素均可显著减少血中的乙醇量，降低乙醇毒性可大幅度减少乙醇中毒大鼠血清ALT、AST［11］。枳椇子，其有清热解毒、利尿解酒毒之功效。现代研究表明，枳椇子可增强血中谷胱甘肽过氧化物酶的活性从而促进乙醇的代谢［12］。

本实验研究从肝组织病理学、肝功能变化等方面证明，中药复方双葛解酲丸具有明显的对抗酒精性脂肪肝的作用，海王金樽片是目前很常用的一种解酒药，具有保肝护肝的作用，本实验中，双葛解酲丸高剂量组对脂肪肝的效果明显好于海王金樽组(P＜0.01)，说明双葛解酲丸在大剂量的时候其作用优于西药海王金樽片，并且制作方便，价格便宜，如果能做成方便剂型，将对酒精性脂肪肝病的早期防治起到很良好的作用。

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