慢性酒精中毒患者血清内皮素-1含量检测的意义

于 洋 姜 涛 姜立刚 刘立峰，3 (北华大学校医院，吉林 吉林 303)

长期大量饮酒对人体各个系统的危害较严重，如神经系统、消化系统、心血管系统、造血系统，而且酒精中毒对人们的精神健康及心理健康也有很大的伤害。目前在临床上诊断酒精中毒的方法均局限在依靠临床表现及心理学标准，缺乏实验室检查标准。ET-1主要由血管内皮细胞分泌，是一种最强有力的缩血管物质，在血管相关性疾病，如高血压、冠心病、肺动脉高压症、急性缺血性卒中等疾病当中研究较多。本研究探讨酒精中毒患者血清中ET-1含量的变化及其临床诊断意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例组 北华大学附属医院神经内科门诊就诊的慢性酒精中毒患者40例，年龄28～68〔平均(48.2±18.6)〕岁，饮酒年限5～35年，所有患者每日饮酒量均超过40 g。诊断均符合酒精所致精神障碍，参照中国精神障碍分类与诊断标准(CCMD-3)。把酒精中毒患者按饮酒年限分为饮酒20年以下组(包括20年)和饮酒20年以上组，按有无高血压分为高血压组、无高血压组。所有酒精中毒患者均无急性心肌梗死、心力衰竭、缺血性卒中、出血性卒中等病史。

1.1.2 对照组 20例，年龄26～60〔平均(45.6±14.7)〕岁，为同一时期体检者，平时不饮酒或偶尔饮少量酒。无任何器质性疾病。

1.1.3 主要试剂及仪器 人ET-1 ELISA试剂盒，武汉华美生物工程有限公司提供。超低温冰箱 MPF-2AJ;微量移液器 (吉尔森 1 000 μl、200 μl、100 μl、20 μl);涡力搅拌器 M37610-26;全自动酶标仪 MK2;高速离心机 B320A;电热恒温培养箱MCO-15A。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及保存 取患者及健康者静脉血5 ml，在室温放置2～4 h后，用高速离心机以1 000 r/min离心20 min，取上清液后放置于-70℃超低温冰箱中保存。所有患者在未进行任何治疗的情况下采血。

1.2.2 方法及结果判定 将血清标本解冻至室温。实验前20 min从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。提前配置好所有试剂，配制标准品的时候采用倍比稀释法。加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μl，余孔分别加标准品(100、50、25、12.5、6.2、3.2 pg/ml)或待测样品100 μl，酶标板加上盖或覆膜，在37℃电热恒温培养箱反应120 min。弃去液体，甩干，不洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100 μl(取1 μl生物素标记抗体加99 μl生物素标记抗体稀释液，轻轻混匀，在使用前1 h内配制)，在37℃电热恒温培养箱温育60 min。然后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min，200 μl/每孔，甩干。每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液)100 μl，在37℃电热恒温培养箱温育60 min。然后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1～2 min，200 μl/每孔，甩干。依序每孔加底物溶液90 μl，在37℃电热恒温培养箱避光显色(30 min内，此时肉眼可见标准品的前3～4孔有明显的梯度蓝色，后3～4孔显色不明显，即可终止)。依序每孔加终止溶液50 μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。按照终止液的加入顺序将底物液加入。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后15 min以内进行检测。用Curve Exert 1.3软件绘制标准曲线。将浓度作为X轴(对数轴)，OD值作为Y轴(线性轴)。根据样品OD值，在曲线图上查出相应ET-1含量。

1.3 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件，数据资料以s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 结果

2.1 酒精中毒组与正常对照组血清ET-1水平比较 慢性酒精中毒患者血清ET-1水平明显高于正常对照组〔(19.43±5.22)pg/ml vs(8.97 ±2.98)pg/ml〕(P ＜0.01)。

2.2 三组血清ET-1水平比较 酒精中毒合并高血压组与酒精中毒无高血压组相比 ET-1水平有明显差异〔(22.43±4.28)pg/ml vs(16.43±4.32)pg/ml〕，有统计学意义(P ＜0.01);酒精中毒合并高血压组与酒精中毒无高血压组均明显高于正常对照组。

2.3 饮酒20年以上组及以下组与正常组ET-1水平比较 慢性酒精中毒饮酒20年以下组与饮酒20年以上组ET-1水平无明显差异〔(19.95±4.08)pg/ml vs(18.71±6.24)pg/ml〕(P＞0.05)。

3 讨论

ET-1主要由内皮细胞分泌，但血管平滑肌细胞、巨噬细胞、白细胞、心肌细胞、成纤维细胞等也可以分泌ET-1〔1，2〕。在肾脏，肾小管内皮细胞、肾小球系膜细胞、足细胞都可以分泌ET-1〔3，4〕。ET还广泛分布于神经细胞内。在脑内，ET 主要集中于下丘脑、纹状体、大脑皮质及侧脑室中〔5〕。血管内皮损伤或受刺激后ET-1产生及释放增加〔6〕，故ET-1可作为判断血管内皮损伤的一个重要指标。但在酒精中毒方面，特别是在酒精中毒患者中的研究较少。

3.1 酒精与高血压 酒精是否与高血压有关，是否增加高血压的危险性，对于这个问题曾经有不一致的看法。很多学者认为少量饮酒可减少心血管疾病的危险性，这一结论也可能是从酒精可舒张血管这个角度考虑的。WHO指南指出对人体有害的量是男性每天40 g酒精，女性25 g。大量饮酒可增加高血压发生的几率，这一说法已被很多研究证实〔7〕。一项研究表明如果每日摄取40 g以上酒精，那么每10 g酒精会升高10 mmHg的血压，而且少量饮酒(少于12 g/d)也影响血压〔8〕。这也反驳了酒精是舒血管物质的理论。目前饮酒已成为高血压的危险因素之一。引起高血压的机制很多，大量饮酒引起血压升高及增加高血压发生几率的主要原因可能为如下：(1)酒精增加交感神经系统的活性，这彻底清除了酒精是舒血管物质的学说。这也是酒精中毒引起高血压的最主要的因素。(2)乙醇对血管的直接损伤可导致血管内缩血管物质及舒血管物质的平衡打破。(3)酒精中毒可引起镁(Mg2+)的降低，研究结果表明，细胞Mg2+水平低下，降低Ca2+-ATP酶活性，减少肌浆网对Ca2+的重吸收，继而引起Ca2+负荷加重，血管平滑肌张力升高，而使血压升高。(4)酒精可增加肾素-血管紧张素-醛固酮系统的活性。(5)大量乙醇及其代谢产物可直接作用于胰岛B细胞，抑制胰岛素分泌从而增加胰岛素抵抗〔9〕。胰岛素抵抗可引起体内钠潴留，也可能是引起高血压的一个因素。此外可能还有其他机制参与酒精引起血压增高的过程，但是目前大量饮酒引起高血压已经得到证实，继续研究其机制的意义在于进一步进行有效的临床治疗。

3.2 酒精与脑血管疾病

3.2.1 酒精与缺血性脑卒中 酒精在缺血性脑卒中方面的作用研究结果不一致的原因可能是在于饮酒量及酒精饮料种类的不同。西方人较喜欢喝香槟、葡萄酒、啤酒等，东方人特别是韩国、日本、俄罗斯人都比较喜欢喝烈性酒。研究表明适量饮用葡萄酒可降低心脏病及缺血性脑卒中的发生，少量或中等量的饮酒可减少缺血性脑卒中的发生，而大量饮酒则成为缺血性脑卒中的一种危险因素〔10〕。国内研究表明〔11〕饮酒量在60 g/d以上者发生缺血性脑卒中的危险是不饮酒者的1.96倍。饮酒量在0～15 g/d者，发生缺血性脑卒中事件的危险略有下降，然而并无统计学意义。说明小量饮酒虽然并不增加缺血性脑卒中发生的危险，但这并不能说明小量饮酒能减少缺血性脑卒中危险。因此即使少量饮酒可引起发生缺血性脑卒中事件的危险下降，但也不能作为一种治疗手段用在缺血性脑卒中。尽早戒酒才是治疗的关键。大量饮酒导致发生缺血性脑卒中的危险性增加的原因分析如下：(1)大量饮酒可导致高血压，而高血压是缺血性脑卒中的独立危险因素之一。(2)大量饮酒可导致心律失常，其中心房纤颤是引起脑栓塞的最常见的原因。(3)大量饮酒可诱发血小板聚集和血栓素B2(TXB2)的成及前列腺素E2(PGE2)的形成，从而成为脑梗死的重要危险因素。(4)大量饮酒可使纤维蛋白溶解活性降低，纤维蛋白自发溶解时间明显延长，增加红细胞压积，减低红细胞柔韧性，使红细胞聚集性显著增强，导致微循环通路阻力普遍增加，降低脑血流。(5)大量饮酒可导致肥胖、血脂异常〔12〕。这些均是导致缺血性脑卒中的危险因素。

3.2.2 酒精与出血性脑卒中 大量饮酒不仅增加缺血性组中的危险性而且也增加出血性脑卒中的危险性。酒精在缺血性脑卒中的影响是通过长期饮酒的慢性过程。而出血性脑卒中的报道多关于一次大量饮酒后，即急性酒精中毒。与非急性酒精中毒后脑出血相比急性酒精中毒合并高血压的脑出血患者意识障碍程度重、出血量大，故病情重、预后差，可见这种急性酒精中毒后脑出血不完全是一次大量饮酒后造成的，而是长期饮酒造成机体损害的前提下又一次性大量饮酒造成的。大量饮酒增加出血性脑卒中危险的原因：(1)饮酒后乙醇作用于脑中突触后膜苯二氮-γ-氨基丁酸受体，从而抑制了γ-氨基丁酸对脑的抑制作用，引起中枢兴奋，这种兴奋可引起情绪激动，血压升高，诱发脑出血;(2)长期大量饮酒可导致肝功能损害，进而引起凝血功能异常;(3)酒精可直接抑制血小板生成与成熟，使其寿命缩短，由正常(8.5±0.2)d缩短为3.8 d〔13〕。

本研究结果显示慢性酒精中毒患者血清ET-1水平明显高于正常对照组。ET-1可能与酒精中毒有关，并且对其诊断可能有意义。这一结果与一些动物实验研究结果一致。有研究发现长期酒精灌胃的大鼠血浆内皮素含量明显高于正常大鼠;也有研究采用灌胃法给予家兔含乙醇50%的白酒8 ml·kg-1·d-1)，灌胃4～6个月时家兔血浆ET-1逐渐升高;一些体外研究也表明酒精与ET-1有密切关系;在内皮细胞培养基中加入低至高浓度的乙醇，可明显减少经过氧化氢损伤的内皮细胞分泌ET，然而在乙醇作用24 h后，对照组和低至中浓度组均比2 h ET明显减少，只有高浓度乙醇组ET反而显著增高，考虑此时过氧化氢已挥发，仅剩下乙醇对内皮细胞的作用，提示长期高浓度乙醇对内皮细胞有明显损害作用。这与国外的体外实验结果也一致〔14〕。酒精可引起ET-1升高的原因分析如下：(1)ET-1是血管内皮损伤的标志，任何引起血管内皮损伤因素均可导致ET-1升高。(2)酒精中毒可导致血管内皮损害，酒精中毒引起的氧自由基增加和机体清除氧自由基的能力下降可能是其原因。有研究通过用电子显微镜观察吸入酒精14 d的大鼠海绵体的组织学变化，得出酒精可导致内皮细胞损伤的结论。酒精导致血管内皮损伤的机制尚未完全明确，但是可能与余下几个原因有关。(1)乙醇或其代谢产物直接对血管内皮产生刺激作用。(2)酒精导致内皮细胞的凋亡。研究发现长期过量饮酒能够导致氧化-抗氧化系统失衡，氧自由基增加且其病理性反应加剧，进而能够引起血管内皮细胞凋亡〔15〕。

本研究表明酒精中毒合并高血压组与酒精中毒无高血压组相比有明显的差异，有统计学意义(P＜0.01)。这一结论说明ET参与了酒精中毒引起高血压的发病过程。ET是一种最强有力的缩血管物质。曾有多项研究报道在高血压患者中有ET升高。有研究〔16〕把原发性高血压患者按级别分为三个组，高血压1级、2级、3级。测定ET值，结果显示高血压1级患者组与正常组无明显差异，2级组与3级组则明显高于对照组。虽然也有学者有不同的意见，但是本研究结果也是在有高血压与无高血压患者血清中ET-1有明显的差异。长期大量饮酒后可损伤内皮细胞，引起ET-1升高，ET-1可引起高血压。而酒精中毒患者长期处在这样高血压状态时进一步的损伤血管内皮，因此可增加心脑血管疾病发生的危险。

本研究表明慢性酒精中毒饮酒20年以下组与饮酒20年以上组血清ET-1无明显差异。但是有些研究表明饮酒年限与酒精对机体的损害程度有关〔17〕。随着饮酒年限的增加，酒精中毒患者对酒精的耐受性增加，因此饮酒量也会增加。可见最终关键还是饮酒量。适量饮酒可降低心脑血管疾病的危险性，但是长期大量饮酒可增加心脑血管疾病的危险性。故问题关键在于减少每日饮酒量，尽早戒酒，减少酒精对机体的危害。

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