正交法优化槐米中芦丁的超声提取工艺

付起凤，王德娟，孟凡佳

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

槐米(Flos Sophorae)为豆科植物槐(Sophora japonica L)的干燥花及花蕾，该药性微寒、味苦，具有凉血止血，清肝泻火的功效，用于便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝热目赤、头痛眩晕［1］。药理研究表明，槐米中所含主要成分为芦丁(Rutin，维生素P)，又称芸香苷，芦丁难溶于冷水(1∶8 000)，略溶于沸水(1∶200)。本实验是根据芦丁在冷水和热水中的溶解度差异较大的特性，以槐米为原料，采用超声法进行提取，用空气冷凝回流法进行精制。用高效液相色谱法测定芦丁的含量。通过正交设计法对超声提取时间、提取温度、提取频率进行三因素三水平试验，以此来确定超声法提取槐米中芦丁的优良工艺。

1 仪器与试药

LC－2010AHT高效液相色谱分析仪(日本岛津);KQ－500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);SHB－IIIB循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);DHG－9140A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司);AB204－N型万分之一电子天平(Metter Toledo CORPORATION);槐米药材(购于哈尔滨宝丰药店);芦丁对照品(购于中国药品生物制品有限公司);甲醇为色谱纯;冰醋酸为分析纯;实验用水为二次蒸馏水。

2 方法与结果

2．1 槐米中芦丁的提取方法

向500ml的烧杯中加400ml蒸馏水，在电炉子上加热至沸腾，缓缓加入20．0g槐米粗粉并不断搅拌，继续煮沸2min，然后将烧杯转移到超声清洗器中进行超声提取后，静置，取上层絮状物抽滤，并干燥后得粗品芦丁，将该产物于100ml圆底烧瓶中并加入15～20ml甲醇进行回流冷凝40min，趁热过滤得滤液，将其放冷至结晶完全后过滤得精品芦丁，将其于105℃干燥至恒重得干燥的精品芦丁。

2．2 色谱条件

固定相:Hypersil ODS2 C18色谱柱(4．6mm×150mm，5μm);保护柱(大连物化所 依特利公司);流动相:甲醇－1%冰醋酸(40∶60V/V)溶液，应用前经0.45μm微孔滤膜过滤，并超声脱气;流速:1．0ml/min;检测波长为257nm;进样量为10ml;柱温为30℃。该色谱条件的对照品及样品的色谱图见图1，图2。

2．3 标准曲线的制备

取在105℃干燥至恒重的芦丁对照品50．0mg于50ml容量瓶中，用色谱甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成1mg/ml的溶液，作为储备液。分别取适量储备液加入色谱甲醇配制成 5，10，25，100，150，300μg/ml的芦丁色谱甲醇溶液。按前述色谱条件取10μl进样，测定峰面积。以浓度X为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，见表1。结果如图3所示。

表1 标准曲线的绘制(±s)

表1 标准曲线的绘制(±s)

浓度(μg/m l)5 10 25 100 150 300峰面积(A)79 336 158 752 426 871 1 726 4662 565 101 5 387 017

并以Y对X进行线性回归，得回归方程Y=17 921．171 6X －38 324．711 3 r=0．999 7。

图1 对照品色谱图

图2 样品色谱图

表2 精密度实验结果

表3 重复性考察结果

图3 标准曲线图

通过回归方程和标准曲线可以看出，芦丁对照品在5～300μg/ml浓度范围内，其峰面积与浓度成良好的线性关系。

2．4 样品的测定

对照品溶液的配制:取上述贮备液5ml，加入色谱甲醇至50ml并摇匀，使配制成浓度为100μg/ml的芦丁溶液。

供试品溶液的配制:取样品5．0mg，精密称定，加入色谱甲醇溶解并稀释至50ml，制成每1ml含100μg芦丁的溶液，用微孔滤膜过滤，直接进样，用外标法测定。

2．4．1 仪器精密度实验

取芦丁对照品溶液(浓度为100μg/ml)，选用同一色谱条件及同一进样量(10μl)，重复进样5次，测定供试品的峰面积(S)，计算其精密度的RSD%。其峰面积(S)和保留时间的相对标准偏差分别为0.28%(＜1．5%)、0．77%(＜1．5%)。仪器精密度良好。

2．4．2 重复性实验

分别取3份槐米药材粗粉约20．0g，精密称定，按样品4的条件提取，再依供试品溶液的制备方法操作，得3份供试品溶液，随行芦丁对照品(浓度为100μg/ml)溶液作对照，在波长257nm处测峰面积值，计算RSD为2．53%。重复性较好。

2．5 正交试验考察提取工艺

2．5．1 正交试验设计

根据单因素试验及超声清洗器的功能范围，本实验选择固定料液比(1∶20)、超声频率(40kHz)及提取次数(2次)，考察影响槐米中芦丁的超声提取工艺的主要影响因素范围，即提取温度为80℃、70℃、60℃，提取时间为10min、20min、30min，提取功率为200W、300W、400W，据此选用 L9(34)正交试验设计［2］，见表4。

2．5．2 正交试验与结果分析

2．5．2．1 正交试验

取槐米药材粗粉20．0g，精密称定，按照上述槐米中芦丁的提取方法进行提取，再依供试品溶液的制备方法操作，按L9(34)正交表设计方案进行试验，用高效液相色谱法对槐米提取物中芦丁进行含量测定［3］。见表5。

表4 L9(34)正交试验因素水平表

表5 L9(34)正交试验表

表6 正交试验方差分析

2．5．2．2 结果分析

根据方差分析结果可知，以槐米中提出芦丁的百分含量为指标，槐米在以水为溶剂用超声法进行提取时，各个因素对槐米提取效果的影响程度不同。直观分析显示，温度是影响芦丁提取量的主要因素，其次为提取功率;方差分析结果表明，提取温度具有显著性差异，且各因素的影响程度依次为A＞C＞B，所以对提取效果影响有统计学意义的因素是提取温度A。因此超声法提取槐米中芦丁较理想的提取工艺方案是A2B2C3，即在固定料液比(1∶20)、超声频率(40kHz)及提取次数(2次)的条件下，提取温度为70℃，提取时间为20min，提取功率为400W时，提取效果最佳。

3 讨论

本实验以槐米为研究对象，考察了以水为溶剂，采用超声提取法来提取槐米中芦丁成分，并以槐米中提取出芦丁百分含量为评价指标，以芦丁为对照品，采用高效液相色谱法测定提取芦丁的含量;并利用正交试验的方法来优选出提取槐米中芦丁的最佳工艺。经查阅文献，确定出槐米中芦丁提取工艺的主要影响因素可以包括为提取温度、提取时间、提取功率及提取频率等多个因素，根据实际情况选用了前三个因素，并采用L9(34)正交试验表，进行了多次试验，最后综合结果分析，得到超声法提取槐米中芦丁的最佳工艺，即在固定料液比(1∶20)、超声频率(40kHz)及提取次数(2次)的条件下，提取温度为70℃，提取时间为20min，提取功率为400W时，提取效果最佳。为优化槐米中芦丁的超声法水提取工艺提供了参考依据。

用超声法提取槐米中的芦丁时，适宜的超声提取条件可提高芦丁的产率。优选出的提取工艺条件简单易行、提取速度快，节省了提取时间，提高了实验效率。

由于该实验所用的超声清洗器功能有限，所选择的条件范围受到了限制，槐米中芦丁的提取率不是很理想，但在实验室现有的条件下该实验确实对槐米中芦丁的超声提取工艺起到了优化作用;如果将超声清洗器改为超生提取器，我们就可以考察更多的试验因素，并且每个因素也可以通过单因素考察法确定出更好的实验水平范围，再通过正交设计试验优选出提取率更佳的实验方案。

［1］马双成．中国药典［S］．北京:人民卫生出版社，2010:333．

［2］经明，王宏，曾祖平，等．正交试验筛选心衰颗粒提取工艺的研究［J］．中国实验方剂学杂志，2008，14(8):29 －31．

［3］邓富良，陈本美，陈国华，等．高效液相色谱法测定槐米中的芦丁含量［J］．湖南医科大学学报，2005，25(6):598－600．