猪繁殖与呼吸障碍综合征检测方法的研究进展

钱根林 樊彦红 潘冬春

（1.吴江市畜牧兽医站，吴江 215200；2.吴江市松陵动物防疫站，吴江 215200）

猪繁殖与呼吸障碍综合征又称猪高致病性蓝耳病，由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）感染所致。该病在中国的流行和分布十分广泛，危害日趋严重，成为威胁猪场的以繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染性疾病，目前该病已存在于世界上所有养猪的国家及地区，且一般与圆环病毒等混合感染，已成为对养猪业具有重大危害的动物疫病，由于目前尚无有效药物可对PRRS病猪进行治疗，在临床上主要是依靠注射PRRSV的疫苗对易感动物进行免疫，然后定期对抗体进行监测并根据监测结果制订相应的免疫措施的方法对本病进行预防。本文简要介绍了PPRS检测方法的研究概况。

1 PRRSV病原的检测

针对PRRSV的病原进行的检测，主要是靠分离PRRSV，然后进行细胞培养和病毒鉴定。目前报道的用于培养PRRSV的细胞有猪肺巨噬细胞（PAM）、MA104 细胞系的克隆株Marc-145 及HS2H 细胞、CL2421 细胞[1-2]。PAM对PRRSV有较高的敏感性，大多数毒株均适应该细胞，特别是欧洲毒株，且产毒量高。但由于PAM存在猪肺原性病原体的污染，制备的技术难度大，难以获得均质的PAM等问题，应用受到限制。Marc-145 细胞在接种后4～7 d出现细胞呈灶状变圆，膨大之后皱缩脱落成灶状空洞，病料以血清和肺组织样本分离率为最高，血清样本最为方便。用HS2H细胞作为PRRSV分离用细胞，具有较高的敏感性，细胞病变典型，并且由于它是传代细胞系，制备简单，容易获得，适宜于一般实验室培养、分离PRRSV。

2 PRRSV的血清学检测

血清学检测技术主要包括免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫胶体金技术、间接免疫荧光试验（IFA）和血清中和试验（SN）等。血清学检测技术因操作简便，且敏感性和特异性较高，已成为猪繁殖与呼吸障碍综合征的主要检测方法之一。

IPMA是PRRS抗体检测的重要方法之一。此法敏感性和特异性都比较好。可用于PRRSV的抗原检测、病毒鉴定及血清抗体检测。Wensvoor等建立的IPAM检测PRRS抗体至今仍是欧洲常用的检测手段[3]。IPMA具有特异性，敏感性结果与IFA相似。但此法在判定上有主观性，且费时，检测价格贵。血清中和试验（SN）检测PRRS 抗体特异性高，但因PRRS中和抗体出现晚而不适宜于早期诊断。Yoon等[4]人通过添加20%新鲜猪血清或豚鼠血清提高补体含量对SN 法进行改良，能够检出感染后的9～11 d的抗体。PRRS中和抗体持续时间可长达6个月，此法可用于PRRS后期诊断和区分PRRSV毒株。

酶联免疫吸附试验因其条件要求低，操作简单，稳定性好，特异性敏感性高适用于基层兽医工作，现已被广泛应用于PRRSV抗体检测。建立此项诊断技术的关键在于病毒的细胞培养和病毒作为ELISA 抗原的纯化处理。Cho 等[5]应用Triton- X100 制备获得高纯度的ELISA 抗原，辅以高效封闭试剂，使该法具有高特异性、高敏感性和快速经济的特点。此法优于IMAP，被广泛应用于生产中PRRSV抗体的检测。Seuberlich 等[6]报道了用竞争ELISA来检测PRRSV，同时与间接免疫荧光试验（IFA）和传统ELISA技术进行比较，结果显示其敏感性和特异性都很高，可以作为日常的诊断和监测方法。

免疫胶体金技术是近年来发展起来的快速诊断技术，目前已有商品化的胶体金试纸出售，该法操作简单，诊断时间短，适合基层推广使用，但是在基层使用中发现有假阳性和假阴性现象的出现，因此需要在检测的灵敏度和准确度方面进行提高，满足生产需要。

3 分子生物学诊断

PRRSV的分子生物学诊断技术包括：反转录PCR技术（RTPCR），核酸探针技术和DNA微阵列技术。

RT-PCR 是检测PRRS的主要手段。其原理是扩增病毒特异而保守的基因片段，PRRSV 主要是扩增ORF7。RT-PCR提供了一种良好的可替代细胞培养检测PRRSV 的方法。

Christopher 等[7]首先建立了检测猪精液中PRRSV的RT-PCR方法，该方法快速、敏感、可靠、实验接毒92 d后，仍可从猪精液中检测病毒RNA。在RT- PCR 的基础上发展起来的巢式PCR、定量Real-Time RT-PCR，巢式RT-PCR 均可用于PRRSV的检测和定型，还提高了检测的敏感性。

Sur 等[8]以PRRSV 的RNA为模板，通过RT-PCR 扩增ORF7 中的433 bp 片段，应用地高辛标记方法制备PRRSV 特异性cDNA 探针，建立了检测PRRSV原位杂交技术，该法可在肺、淋巴组织、肺泡巨噬细胞（尸体剖检后灌洗获得）、淋巴结、肾脏的感染细胞内检测到PRRSV 的RNA，较免疫组化具有更高的敏感性和特异性，特别适合感染后期的细胞内PRRSV的RNA的检测。该方法不仅能够证明猪体内确实存在有PRRSV，而且能够对PRRSV 在体内器官中的动态分布情况进行追踪检测。

Lee 等[9]建立了基因芯片技术用于GP4 和GPS 对细胞基因表达影响的研究。以Hela 细胞系为PRRSV GP5 蛋白稳定的表达载体，应用免疫荧光技术、Western 杂交和免疫沉淀试验均未观察到细胞凋亡现象；同时还检验了Marc-145 细胞与HeLa 共同培养时GP5表达对Marc-145 细胞的影响也未发现凋亡现象的存在。使用细胞凋亡芯片检测证实GP5 表达不能引起细胞凋亡，由于GP5 的表达与免疫反应有关，因此其表达谱能用于PRRVS的诊断。

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