蛋白激酶C和磷脂酰肌醇4，5二磷酸之间相互调节作用的研究进展

陈兴娟，张熙东，张璇，杲海霞，张海林

(河北医科大学药理学研究室，河北石家庄050017)

蛋白激酶C和磷脂酰肌醇4，5二磷酸之间相互调节作用的研究进展

陈兴娟，张熙东，张璇，杲海霞，张海林

(河北医科大学药理学研究室，河北石家庄050017)

蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是一个多基因家族，包含多种同工酶，分布广泛且功能复杂，在许多信号转导通路发挥重要作用。磷脂酰肌醇(4，5)二磷酸(PIP2)是分布在细胞膜中的磷脂类信号分子，在细胞中的分布和含量处于动态变化中。PIP2的水解后生成DAG和IP3。DAG可以直接激活PKC，而IP3通过调节细胞内钙离子的浓度从而改变钙依赖型PKCs的活性。同时，PKC通过激活PI4K或PIP5K可以调节细胞膜PIP2水平。PKCs使离子通道蛋白发生磷酸化，改变通道蛋白与PIP2的亲和力，从而影响PIP2对离子通道的调节。该文对PKCs和PIP2在细胞信号转导过程中相互调节的相关研究进展进行综述。

蛋白激酶C;磷脂酰肌醇(4，5)二磷酸(PIP2);钙离子;磷脂酶C(PLC);信号转导;调节

磷脂酰肌醇4，5二磷酸［phosphatidylinositol(4，5)bisphosphate，PI(4，5)P2，简称IP2］属于膜磷脂类，对许多细胞生理活动有调节作用。最初人们认为PIP2的作用主要是作为细胞中重要的第二信使三磷酸肌醇［insoitiol 1，4，5 trisphosphate，Ins(1，4，5)P3，简称IP3］和甘油二酯(diaceylglycerol，DAG)的前体。近年大量研究证据表明PIP2本身也是一种重要的第二信使。PIP2自身和许多细胞内信号物质有相互作用，至今已经发现大约有100多种蛋白质与PIP2可能有相互作用。因此直接影响细胞膜PIP2水平变化的磷脂酰肌醇的代谢也成为研究者关注的焦点之一。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是一个多基因家族，包含多种同工酶，分布广泛且功能复杂。PKCs通过使底物发生丝氨酸或苏氨酸磷酸化调节底物的生物活性进而参与不同的信号通路，其中PIP2合成过程中的重要激酶PI4K和PIP5K(PI4K使PI肌醇环四位发生磷酸化生成PIP，后者进一步在PIP5K的催化作用下五位发生磷酸化，最终生成信号分子PIP2)都可能就是PKCs的底物。PKC通过激活PI4K或PIP5K调节PIP2细胞膜水平。同时，G蛋白偶联受体和生长因子类受体在受到细胞外信号分子的刺激后可以激活PLC，水解PIP2生成DAG和IP3。DAG可以直接激活PKC，而IP3通过调节细胞内钙离子的浓度从而改变钙依赖型PKCs的活性。此外，PKCs使对PIP2敏感的离子通道发生磷酸化，改变了通道蛋白与PIP2的亲和力从而影响PIP2对离子通道的调节。PKCs和PIP2既独立参与细胞信号传导又相互影响相互调节。

本文就近年PKCs对PIP2在细胞信号转导过程中相互调节的研究进展作一综述。

1 PIP2调节PKCs活性

细胞外信号如激素、生长因子类和机械刺激等激活G蛋白偶联受体或酪氨酸激酶受体(RTKsR)，刺激信号传入细胞后，活化PLC水解PI(4，5)P2，生成IP3和DAG。这是我们熟知的过程，根据PKC的激活特性可知，这一过程中的三个信号分子对不同亚型PKCs的活化都有调节作用。

Lai CL实验室通过分子对接模拟试验证明传统cPKCs (包括PKCα，βⅠ，βⅡ和γ)的C2结构与PIP2存在相互作用［1］。传统PKCs(cPKCs)与细胞膜的结合是钙依赖性的，有研究结果表明cPKCs的C2结构可以通过β3–β4的区域与细胞膜上的PIP2相互作用，这对PKCs在细胞膜的定位具有很重要的意义，更有意思的是PKC只对PIP2的亲和力高而与其他多聚磷酸磷脂酰肌醇没有作用。进一步研究结果表明cPKCs的C2结构与细胞膜PIP2的结合降低了PKC锚定在细胞上所需钙离子的浓度［2］。细胞膜上PIP2的浓度可以影响PKCα在细胞膜上分布［3］:研究结果表明PC12细胞经过ATP处理以后，细胞膜上PIP2的浓度升高同时使PKCα在细胞膜的分布范围扩大，而这一过程却与DAG的生成没有关系。细胞膜上PIP2水平下降，使PKC蛋白向细胞膜转移减少，并且缩短了蛋白在细胞膜上的停留时间。实验结果显示PKCα的C2结构中的多元酸富集区域是与PIP2相互作用的结构基础，这种相互作用与神经细胞的分化有关。

2 PKC对细胞膜PIP2水平和分布影响

PIP2在细胞膜的合成主要受Ⅰ型磷脂酰-4-磷酸-5激酶的调控(PIP5K)，PIP5K催化PIP肌醇环5位发生磷酸化生成PIP2

［6］。如前所述PIP2是细胞众多生命活动不可缺少的辅助因子，如网格蛋白依赖性的胞吐作用、非网格蛋白依赖的胞吐、钙依赖的神经递质和激素的分泌作用、细胞骨架肌动蛋白的重排、细胞迁移和整连蛋白介导的细胞基质黏附作用等［7-8］。影响I型PI4P5K的因素主要是小G蛋白Rho、Rac和Cdc42［9］。PIP2的前体PI(4)P主要在高尔基体膜上生成并储存［7］，PI4K以PI为底物催化肌醇环四位发生磷酸化［10］，但是PI4K确切的调控机制以及生成PIP如何转运到细胞至今还不清楚。如前所述PIP2的合成是发生在细胞膜上的，因此我们可以推测在PI4K同工酶、小GTPase和转运连接器或支架蛋白之间存在一种可调控的相互作用网络关系，以便于在高尔基体-内质网之间形成为满足不同转运途径的聚集PIP的小池。而PI4K活性的影响因素近年也受到关注:在牛的精子获能实验中［11］，结果表明PI4K的激活有两种途径即直接被PKA激活，由PI3K介导;由PKC激活不依赖于PI3K。而本实验室的研究结果也表明，爪蟾卵母细胞中细胞膜的去极化增加细胞膜PIP2水平［12］，而这一现象可能就是PKC介导的PI4K活性增加促进PIP2的合成［13］。

受体介导的PI4P生成增多依赖于PKC的活性。研究［18］揭示PKC抑制剂Gö-6976(只对传统的蛋白激酶C(cPKCs)和蛋白激酶D(PKD)有作用而对新型的蛋白激酶C (nPKCs)没有作用)对卡巴胆碱所引起的细胞的PIP水平的升高没有明显作用。相反，Gö-6976的结构类似物Gö-6983 (对传统的和新型的蛋白激酶C都有抑制作用，但是对PKD没有作用)却能明显抑制卡巴胆碱升高PIP的作用，同样也影响了卡巴胆碱升高PIP2的作用。3 μmol·L-1的葡萄糖和1 μmol·L-1的PMA都能升高细胞PIP水平。与卡巴胆碱不同的是PMA升高PIP的作用并不依赖于细胞内钙离子浓度的升高，但是PMA的作用能够被LY294002和Gö-6983所抑制，而不被Gö-6976抑制。因此作者认为受体激活介导的PIP合成增多和PLC介导的DAG升高以及PKC的激活有关。

3 PKC影响PIP2对离子通道的调节

随着对PIP2作用研究的深入，PIP2对离子通道的调节作用已经得到大家公认。PIP2通过和细胞膜上的通道蛋白相互作用，发挥影响离子通道功能的作用。PKC是丝氨酸/酸酸磷酸激酶，许多实验发现PKC使与PIP2有相互作用的离子通道蛋白发生磷酸化，改变通道蛋白与PIP2的亲和力，从而影响PIP2对离子通道的调节作用。

在海马神经元中，毒蕈碱受体的激活后通过PLC/PKC通路抑制GIRK通道［14］;谷氨酸受体介导的电流抑制是通过PLA2/花生四烯酸通路。GqPCR引起的电流抑制的机制是由PKC和花生四烯酸介导的PIP2和通道的相互作用降低实现的［15］。研究发现PMA作为PKC的激动剂［16］可以抑制M电流［17］，但是机制尚未明确，有报道称这种抑制作用是PKC对离子通道蛋白的直接作用，也有的称是PKC通过影响PIP2水平而对电流产生抑制作用。

胆固醇抑制颈上神经节M钾电流的作用可以被PKC的抑制剂calphostin C所阻断，实验者同时也发现PKC的激动剂PDBu可以产生类似胆固醇的抑制M电流的作用，由此我们推测胆固醇对M电流的抑制作用是通过激活PKC来实现的。体外激酶活性测定实验结果表明KCNQ2(M通道的分子组成之一)可以被PKC催化发生磷酸化。KCNQ2的突变体(缺乏PKC磷酸化位点)表达的M电流不受胆固醇或PDBu的影响。胆固醇抑制M电流作用机制是通道蛋白被PKC磷酸化。灌流PIP2可以减弱胆固醇和PDBu对电流的抑制作用，由此可推断PKC磷酸化通道蛋白以后，降低了通道与PIP2的作用从而表现为电流的抑制作用［19］。

QT间期延长综合症可以引起尖端扭转型室性心动过速、心室颤动甚至猝死。QT延长综合症的主要遗传因素是构成复极化钾电流IKs的KCNQ1基因的突变。研究表明［20］，肾上腺素受体激活PKA和GqPCR激活PKC都对IKs具有调节作用。进一步的研究［21］发现PKC介导的IKs的激活作用是通过调节通道和PIP2的亲和力来实现的。突变通道对细胞膜PIP2水平的变化变得不敏感，但PKC激活以后可以加强PIP2与通道的亲和力。由此可见PKC可以通过加强PIP2与通道的相互作用削弱突变通道对PIP2水平变化的去敏反应。

研究者使用单通道记录和免疫共沉淀技术研究了内皮素-1激活新鲜分离的家兔冠状动脉细胞内源性TRPC1/C5/ C6通道的机制研究。ET(A)或ET(B)受体拮抗剂BQ-123和BQ788不能阻断内皮素-1激活的TRPC1/C5/C6通道，但是如果同时使用这两种拮抗剂可以阻断内皮素-1的作用［22］。ET(A)和ET(B)受体激活所介导的通道激活作用可以被PKC的抑制剂白屈菜赤碱或抗TRPC1抗体所拮抗，这表明ET受体激活所介导的TRPC1通道的开放是依赖PKC的。同样ET(A)受体所介导的TRPC1的开放可以选择性被PI4K/PI3K抑制剂wortmannin(50 nmol·L-1)和PI-828所阻断。PIP3是PI3K催化PIP2磷酸化的产物。外源性使用diC8-PIP3同样可以激活PKC依赖的TRPC1的开放。这些实验结果表明ET(A)受体激活引起的PKC依赖性的TRPC1通道的开放是通过PI3K催化PIP2生成PIP3来实现的。相反，ET(B)受体介导的TRPC1通道的开放可以被PLC的抑制剂U73122所阻断，同时DAG的类似物OAG同样可以启动PKC依赖的TRPC1的开放。OAG的这种作用又可以被抗PIP2的抗体或高浓度的wortmannin(20 μmol·L-1)所阻断。由此可知ET(B)受体介导的PKC依赖性的TRPC1通道的开放是通过PI-PLC介导DAG的生成以及PIP2依赖的。

4 结语

细胞信号传导在1969年第一次由Martin Rodbell用来描述细胞接收、加工以及最后传递来自细胞外的“信号”如激素、药物或者光照。细胞信号传导过程错综复杂，PKCs毫无疑问参与了多条信号传导通路发挥着重要的作用，荧光能量转移技术用来研究PKCs的定位激活［24］，必定更有助于我们对PKCs调节作用的了解。PIP2对PKCs的影响主要是PIP2本身和PKC的相互作用;以及PIP2的代谢产物IP3和DAG对PKCs活性的调节。但是，对于PIP2的代谢调节仍然缺少充足的实验证据。我们熟知PI4K和PIP5K是PIP2细胞合成必不可少的两个酶，PKC在PIP2合成过程中所扮演的角色也在一步一步被揭示。先进的基因技术和蛋白质组技术将会进一步回答我们今天遗留在PIP2信号通路领域的问题。

［1］Lai C L，Landgraf K E，Voth G A，et al．Membrane docking geometry and target lipid stoichiometry of membrane-bound PKCalpha C2 domain:a combined molecular dynamics and experimental study［J］．J Mol Biol，2010，402(2):301-10．

［2］Corbalan-Garcia S，Guerrero-Valero M，Marin-Vicente C，et al．The C2 domains of classical/conventional PKCs are specific PtdIns (4，5)P(2)-sensing domains［J］．Biochem Soc Trans，2007，35 (Pt5):1046-8．

［3］Marin-Vicente C，Nicolas F E，Gomez-Fernandez J C，et al．The PtdIns(4，5)P2ligand itself influences the localization of PKCalpha in the plasma membrane of intact living cells［J］．J Mol Biol，2008．377(4):1038-52．

［4］Berridge M J，Irvine R F．Inositol trisphosphate，a novel second messenger in cellular signal transduction［J］．Nature，1984，312 (5992):315-21．

［5］Stahelin R V，Wang J，Blatner N R，et al．The origin of C1A-C2 interdomain interactions in protein kinase Calpha［J］．J Biol Chem，2005，280(43):36452-63．

［6］Di Paolo G，Moskowitz H S，Gipson K，et al．Impaired PtdIns(4，5)P2synthesis in nerve terminals produces defects in synaptic vesicle trafficking［J］．Nature，2004，431(7007):415-22．

［7］De Matteis M A，Godi A．PI-loting membrane traffic［J］．Nat Cell Biol，2004，6(6):487-92．

［8］Di Paolo G，De Camilli P．Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics［J］．Nature，2006，443(7112):651-7．

［9］Santarius M，Lee C H，Anderson R A．Supervised membrane swimming:small G-protein lifeguards regulate PIPK signalling and monitor intracellular PtdIns(4，5)P2 pools［J］．Biochem J，2006，398(1):1-13．

［10］Balla A，Balla T．Phosphatidylinositol 4-kinases:old enzymes with emerging functions［J］．Trends Cell Biol，2006，16(7): 351-61．

［11］Etkovitz N，Rubinstein S，Daniel L，et al．Role of PI3-kinase and PI4-kinase in actin polymerization during bovine sperm capacitation［J］．Biol Reprod，2007，77(2):263-73．

［12］Zhang X，Chen X，Jia C，et al．Depolarization increases phosphatidylinositol(PI)4，5-bisphosphate level and KCNQ currents through PI 4-kinase mechanisms［J］．J Biol Chem，2010，285 (13):9402-9．

［13］Chen X，Zhang X，Jia C，et al．Membrane depolarization increases membrane PtdIns(4，5)P2 levels through mechanisms involving PKC betaII and PI4 kinase［J］．J Biol Chem，2011，286(46): 39760-7．

［14］Zhang L，Lee J K，John S A，et al．Mechanosensitivity of GIRK channels is mediated by protein kinase C-dependent channel-phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate interaction［J］．J Biol Chem，2004，279(8):7037-47．

［15］Sohn J W，Lim A，Lee S H，et al．Decrease in PIP(2)channel interactions is the final common mechanism involved in PKC-and arachidonic acid-mediated inhibitions of GABA(B)-activated K+ current［J］．J Physiol，2007，582(Pt3):1037-46．

［16］杜肖娜，何宏涛，王川，张海林．PKC对两种表达系统中内向整流性钾通道调节的不同及机制研究［J］．中国药理学通报，2008，24(12):1615-9．

［16］Du X N，He H T，Wang C，Zhang H L．Study of the mechanism of different regulation of Kir current in two expressions systems by PKC［J］．Chin Pharmacol Bull，2008，24(12):11615-9．

［17］Nakajo K，Kubo Y．Protein kinase C shifts the voltage dependence of KCNQ/M channels expressed in Xenopus oocytes［J］．J Physiol，2005，569(Pt1):59-74．

［18］Wuttke A，Sagetorp J，Tengholm A．Distinct plasma-membrane PtdIns(4)P and PtdIns(4，5)P2dynamics in secretagogue-stimulated beta-cells［J］．J Cell Sci，2010，123(Pt9):1492-502．

［19］Lee S Y，Choi H K，Kim S T，et al．Cholesterol inhibits M-type K+channels via protein kinase C-dependent phosphorylation in sympathetic neurons［J］．J Biol Chem，2011，285(14):10939-50．

［20］Matavel A，Medei E，Lopes C M．PKA and PKC partially rescue long QT type 1 phenotype by restoring channel-PIP2interactions［J］．Channels(Austin)，2011，4(1):3-11．

［21］Matavel A，Lopes C M．PKC activation and PIP(2)depletion underlie biphasic regulation of IKs by Gq-coupled receptors［J］．J Mol Cell Cardiol，2009，46(5):704-12．

［22］Saleh S N，Albert A P，Large W A．Activation of native TRPC1/ C5/C6 channels by endothelin-1 is mediated by both PIP3and PIP2in rabbit coronary artery myocytes［J］．J Physiol，2009，587 (Pt22):5361-75．

［23］Ayada T，Taniguchi K，Okamoto F，et al．Sprouty 4 negatively regulates protein kinase C activation by inhibiting phosphatidylinositol 4，5-biphosphate hydrolysis［J］．Oncogene，2009，28 (8):1076-88．

［24］Stubbs C D，Botchway S W，Slater S J，et al．The use of time-resolved fluorescence imaging in the study of protein kinase C localisation in cells［J］．BMC Cell Biol，2005，6(1):22．

Progress in the research of mutual regulation between PKC and PI(4，5)P2

CHEN Xing-juan，ZHANG Xi-dong，ZHANG Xuan，GAO Hai-xia，ZHANG Hai-lin
(Dept of Pharmacology，Hebei Medical University，Shijiazhuang050017，China)

Protein kinase C(PKC)comprises a multigene family of related serine/threonine kinases that sit at the crossroads of many signal transduction pathways，playing an important role with complex functions．Phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate (PIP2)is a key signaling molecule in cell membrane;it is not only the precursor of soluble inositol phosphate(IP3)and diacylglycerol(DAG)，it can also act as a second messenger itself．Phospholipase C(PLC)hydrolyzes PIP2to generate membranebound DAG，which activates PKC，and IP3，which mobilizes intracellular calcium to regulate the activity of PKC．The activation of PKC increases the activity of PI4 kinase or PIP5 kinase to enhance the synthesis of PIP2．This review deals with the mutual regulation between PKCs and PIP2and current progress in related research．

protein kinase C;PIP2;Ca2+，PLC;signal transduction;regulation

10．3969/j．issn．1001-1978．2012．11．005

A

1001-1978(2012)11-1497-03

R-05;R329．25;R344．5;R345．57;R348．1

2012-06-03，

2012-08-25

国家自然科学基金重点项目(No 30730031)

陈兴娟(1984-)，女，博士生，研究方向:分子药理学，E-mail:xingjuanchen@yahoo．com;张海林(1960-)，男，博士，教授，博士生导师，研究方向:分子药理学，通讯作者，Tel:0311-86265562，E-mail:z_ hailin@hotmail．com

时间: 2012 - 10 - 29 16: 58 网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20121029.1658.005.html