灰毡毛忍冬与忍冬的药理作用比较研究

2012-07-28张小娜徐晓玉

中国药理学通报 2012年11期

张小娜，唐清，侯敏，李烨，徐晓玉

(西南大学药学院，重庆市药效评价工程技术研究中心，重庆市银花工程技术研究中心，西南大学中药研究所，重庆 400716)

金银花和山银花均属忍冬科植物，中医临床传统使用历史悠久，《中国药典》2010年版将金银花与山银花分列，并将灰毡毛忍冬 L.macranthoides Hand.-Mazz作为山银花的来源之一［1］。金银花与山银花的性味归经:甘，寒，归肺、心、胃经;功能与主治:清热解毒，疏散风热，用于痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温热发病。截至目前，关于灰毡毛忍冬的药理作用尚未见系统地研究和报道，本实验将灰毡毛忍冬和忍冬(Lonicera japonica Thunb)的抗菌、抗炎及非特异性免疫调节作用进行了比较研究，旨在丰富药典新收录药材的基础研究。

1 材料与仪器

1.1 试验药物与主要试剂灰毡毛忍冬(产自重庆秀山，购自重庆市秀山红星中药材开发有限公司，批号:110718，经西南大学齐红艺教授鉴定为忍冬科忍冬属植物灰毡毛忍冬的干燥花蕾);忍冬(产自山东平邑，购自山东岐黄中药饮片有限公司，批号:110501，经西南大学齐红艺教授鉴定为忍冬科忍冬属植物忍冬的干燥花蕾);阿司匹林(太极集团西南药业股份有限公司，批号:081101，规格:25 mg/片);角叉菜胶(生工生物工程上海有限公司，批号:51303，规格:500 g/瓶);香菇菌多糖片(开封制药有限公司，批号:20090101，规格:10 mg/片);环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份公司，批号:08120521，规格:0.2 g/瓶)等。

1.2 主要仪器 ELx800型酶标仪，基因有限公司;EL-2046型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司;UV3010紫外分光光度计，日立高新技术公司;光学显微镜，泰盟科技有限公司。

1.3 动物昆明种小鼠，♀、♂兼用，SPF级，体质量18～22 g;SD大鼠，♂，SPF级，体重150～200 g。以上动物均购自重庆医科大学实验动物中心。昆明种小鼠质量合格证号:No 0003962，SD大鼠质量合格证号:No 0000022，动物生产许可证号:SCXD(渝)2007～2006。

1.4 样品溶液制备取灰毡毛忍冬和忍冬各适量，水提醇沉后浓缩成 0.25、0.5、1.0、2.0 g·ml－1储备液，进行抗炎和免疫调节预实验，结果表明浓度为1.0 g·ml－1效果最好，最终确定此浓度为正式试验给药浓度。

2 方法

2.1 抗菌实验［2－3］取灰毡毛忍冬和忍冬各适量煎煮，过滤，除菌，浓缩后，将其分别稀释成1 000、500、250、125 、62.8、31.4、15.7、7.8 g·L－18 个浓度备用。

2.1.1 最小抑菌浓度(MIC)测定在96孔板中加样如下:试验孔1#－8#孔:培养基100 μl+菌液20 μl，再分别加入稀释好的8个浓度的药液120 μL;阴性对照孔9#孔:培养基220 μl+菌液 20 μl;阳性对照孔10#孔:培养基100 μl+2万单位青霉素钠溶液120 μl+ 菌液20 μl;培养基对照孔11#孔:培养基240 μl;空白对照孔:仅加对应浓度的药物和培养基。加完后密封，混匀后置于37℃生化培养箱中培养24 h，观察各孔细菌生长情况，于630 nm下测各孔吸光度，依据吸光度计算MIC。

2.1.2 最小杀菌浓度(MBC)测定根据MIC测定结果，分别吸取未见细菌生长的各管培养液50 μl，涂布于琼脂平板中，置37℃培养箱培养24 h后观察结果。平皿上菌落数小于5的最小稀释度的药物浓度即为MBC。

2.2 抗炎实验

2.2.1 对醋酸致毛细血管通透性增加的影响［4］昆明种小鼠50只，♂，随机分为5组，ig给药，每日1次，连续7 d。末次给药0.5 h后尾iv质量浓度为5 g·L－1伊文斯蓝溶液0.01 ml·g－1，随即 ip 体积分数为0.006 的醋酸溶液0.01 ml·g－1，0.5 h 后处死，生理盐水6 ml洗出腹腔内伊文斯蓝溶液4 ml，3 000 r·min－1离心10 min，590 nm处测定上清液吸光度值，由标准曲线得出每只小鼠腹腔渗入染料量。

2.2.2 对角叉菜胶致大鼠足肿胀的抑制作用［5］SD大鼠40只，♂，随机分为5组，ig给药，每日1次，连续7 d。末次给药前，在大鼠左后足踝处标定测量基线，测量大鼠足趾体积2次，以平均值为基础值。ig给药0.5 h后，于左足趾皮下注射10 g·L－1角叉菜胶 0.1 ml/只，分别于致炎后 0.5、1、2、4、6 h测量足趾体积，计算各组肿胀值(各时间点足趾体积－基础值)和抑制率。抑制率/%=(模型组足肿胀度－用药组足肿胀度)/模型组足肿胀度×100%。

2.2.3 对棉球诱导大鼠肉芽组织增生的影响［6］SD大鼠36只，♂，随机分为4组，ig给药，每日1次，给药7 d后，水合氯醛麻醉，在大鼠两侧肩胛处剪开约1 cm的小口，将棉球分别植入两侧肩胛处皮下，缝合创口。继续ig给药5 d后处死，取出棉球，去除结缔组织，60℃烘箱放置12 h，称重，减去原棉球重量，即为肉芽肿净值，取两侧肉芽肿质量的均值，计算抑制率。抑制率/%=(模型组肉芽肿重量－用药组肉芽肿重量)/模型组肉芽肿重量 ×100%。

2.3 免疫调节实验

2.3.1 对免疫低下小鼠免疫器官重量的影响［7］昆明种小鼠50只，♀、♂各半，随机分为5组，ig给药，每天1次，连续15 d，除空白组外，其余组d10每鼠ip环磷酰胺100 mg·kg－1，每天1次，连续3 d，d16取脾脏和胸腺，以脾重(mg)/体重(10 g)和胸腺重(mg)/体重(10 g)作为脾脏和胸腺指数。

2.3.2 对免疫低下小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响［8］分组给药方法同上，除正常组外，其余组d10每鼠ip环磷酰胺100 mg·kg－1，每天1次，连续3 d。末次给药2 h后，每鼠尾iv印度墨汁0.01 ml·g－1。分别于2 min(T1)和10 min(T2)后从眼球取血 60 μl加到 6 ml 1 g·L－1Na2CO3溶液中，575 nm波长处测OD值。称体重和肝脾重量，计算碳廓清指数K和吞噬指数α。K=(lgA1－lgA2)/(T2－T1)，α =K1/3×体重/(肝重+脾重)。

3 结果

3.1 抗菌实验结果

3.1.1 MIC的测定结果培养结束后肉眼可见，培养基对照孔、空白对照孔颜色、透明度均无变化;阴性对照孔液体浑浊，有白色沉淀产生;两种药材高浓度(1 000、500、250、125 g·L－1)孔也无外观变化;低浓度孔(62.8、31.4、15.7、7.8 g·L－1)有变色现象，液体变浑浊。由Tab 1结果可以看出两种药材对6种常见致病菌均有不同程度的抑菌作用，灰毡毛忍冬对八叠球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌作用比忍冬强，对其他3种菌的抑菌作用均弱于忍冬。

3.1.2 MBC的测定结果培养结束后，培养基对照组无细菌生长;阴性对照组有大量菌落生长，说明实验结果可靠。两种药材对6种常见致病菌均有不同程度的杀菌作用(Tab 2)。结果显示，灰毡毛忍冬对八叠球菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的杀菌效果均比忍冬强，对绿脓杆菌和伤寒杆菌与忍冬相当，对大肠杆菌较忍冬弱。

3.2 抗炎实验结果与模型组相比灰毡毛忍冬1 g·kg－1和忍冬1 g·kg－1均能明显抑制小鼠腹腔毛细血管通透性(P＜0.01);降低大鼠足肿胀度(P＜0.05)和抑制大鼠肉芽组织增生(P＜0.01)，且二者比较差异无显著性(P＞0.05)。结果见Tab 3、4、5。

3.3 免疫调节实验结果灰毡毛忍冬1 g·kg－1和忍冬1 g·kg－1均能明显提高小鼠的脾指数、胸腺指数、廓清指数和吞噬指数(P＜0.01)。以上指标灰毡毛忍冬和忍冬均差异无显著性(P＞0.05)。结果见Tab 6。

4 讨论

忍冬属植物提取物中化学成分复杂，主要含有绿原酸、黄酮类、皂苷类等，目前仍以绿原酸含量衡量其质量优劣，有文献［9］研究表明灰毡毛忍冬中绿原酸含量为忍冬的2倍，体外抗菌试验发现，灰毡毛忍冬对革兰氏阳性菌的杀菌能力强于忍冬，因此，绿原酸对革兰氏阳性菌的杀菌能力是否呈剂量依赖关系值得研究;同时，忍冬对大肠杆菌的杀菌能力强于灰毡毛忍冬，对绿脓杆菌、金葡菌、伤寒杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌能力也强于后者，说明了该类药材的抗菌效果并不完全依赖于绿原酸含量，可能有其他成分起协同作用;体内抗炎、免疫调节试验结果差异无显著性，可能与灌胃给药方式下绿原酸生物利用度低有关［10］，但也可能是由提取物中其他有效成分所致。总之，该实验结果表明了灰毡毛忍和忍冬在上述药理活性上强度相当，为该药材的广泛应用提供了理论依据，而在抗病毒、抗氧化、保肝利胆等方面二者是否存在相同或不同的药效有待进一步研究。

Tab 1 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on MIC in six kinds of pathogenic bacteria(g·L－1)

Tab 2 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on MBC in six kinds of pathogenic bacteria(g·L－1)

Tab 3Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on abdominal capillary permeability in mice(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs normal;##P＜0.01 vs model group

Group Dose/g·kg－1 Inhibitory ratio/%Normal – 0.08 ±0.07 0.04 Abdominal capillary permeability A Azovan blue/mg·L－1–Model – 0.77 ±0.28＊＊ 1.04 0 APC 0.2 0.20 ±0.16## 0.22 78.85 L.macranthoides Hand-Mazz 1 0.37 ±0.07## 0.46 55.77 Lonicera japonica Thunb 1 0.44 ±0.13##0.57 45.19

Tab 4 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on carrageenan-paw edema in rats(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs normal group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs model group

Group Dose/g·kg－1 Content after paw edema/ml Inhibitory ratio after paw edema/%Before edema/ml 0.5 h 1 h 2 h 4 h 6 h Normal － 1.06 ±0.07 0.000.43 0.02 ±0.03 0.03 ±0 0.5 h 1 h 2 h 4 h 6 h.04 0.04 ±0.05 0.03 ±0.04 －－－－－Model - 1.11 ±0.12 0.15 ±0.07＊＊ 0.21 ±0.07＊＊ 0.29 ±0.14＊＊ 0.33 ±0.14＊＊ 0.41 ±0.16＊＊ 0 0 0 0 0 APC 0.2 1.04 ±0.06 0.13 ±0.04 0.17 ±0.08 0.17 ±0.10# 0.24 ±0.11 0.24 ±0.09## 13.33 19.05 41.38 27.27 41.6 L.macranthoides Hand.-Mazz 1 1.12 ±0.07 0.10 ±0.04＊＊ 0.12 ±0.06## 0.15 ±0.09## 0.22 ±0.10# 0.23 ±0.12## 33.33 42.86 42.28 33.3 43.0 Lonicera japoni ca Thunb 1 1.11 ±0.07 0.09 ±0.02## 0.11 ±0.04## 0.21 ±0.15 0.31 ±0.15 0.30 ±0.17 40.0 47.62 27.59 0.03 26.3

Tab 5 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on cotton pellet-induced granuloma in rats(±s，n=9)

＊＊P＜0.01 vs model group

Group Dose/g·kg－1 Model - 40.5 ±5.1 0 APC 0.2 17.5 ±4.3＊＊ 56.8 L.macranthoides Hand.-Mazz 1 25.2 ±7.4＊＊ 37.8 Lonicera japonica Thunb 1 29.5 ±7.3＊＊Increased weight of granuloma/mg Inhibitory ratio/%27.2

Tab 6 Effects of L.macranthoides Hand.-Mazz and Lonicera japonica Thunb on index of immune organ and phagocytosis of macrophages in mice(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs model group

Group Dose/g·kg－1 Index of immune organ Index of thymus/mg·(10 g)－1 Index of spleen/mg·(10 g)－1 Phagocytosis of macrophages K/×10－2α Normal － 13.77 ±2.16 25.91 ±3.91 2.75 ±0.79 6.28 ±0.99 Model - 6.13 ±0.61＊＊ 14.14 ±1.90＊＊ 0.55 ±0.30＊＊ 3.21 ±0.70＊＊LNT 0.0045 9.71 ±1.30## 21.41 ±1.69## 1.70 ±0.70## 5.24 ±1.00##L.macranthoides Hand.-Mazz 1 9.18 ±1.16## 20.08 ±2.34## 1.80 ±0.65## 5.21 ±1.03##Lonicera japonica Thunb 1 8.43 ±1.29## 19.63 ±2.42## 1.56 ±0.74## 4.74 ±1.00##

［1］国家药典委员会编.中华人民共和国药典［S］.一部.2010年版.北京:化学工业出版社，2010:28.

［1］ National Pharmacopoeia Committee.Chinese pharmacopoeia［S］.2010.Beijing:Chemical Industry Press，2010:28.

［2］郭茂福.化学治疗实验方法［M］//徐叔云，卞如濂，陈修，主编.药理实验方法学.第3版.北京:人民卫生出版社，2002:1647－61.

［2］ Guo M F.The experimental methods of chemical treatments［M］//Xu S Y，Bian R L，Chen X，Chief Ed.The methodology of pharmacological experiment［M］.3th ed.Beijing People＇s Sanitation Press，2002:1647 －61.

［3］梅林.秀山金银花、叶、茎中绿原酸的检测及其抑菌作用研究［J］.中国药业，2007，16(3):5－6.

［3］ Mei L.Determination of Chlorogenic Acid from Flos Lonicerae or leaf and its antibacterial activities［J］.China Pharm，2007，16(3):5－6.

［4］王宇翎，张艳，方明，等.白花蛇舌草总黄酮的抗炎及抗菌作用［J］.中国药理学通报，2005，21(3):348 －50.

［4］ Wang Y L，Zhang Y，Fang M，et al.Anti-inflammatory and antibacterial effects of total flavones of oldenlandia diffusa willd［J］.Chin Pharmacol Bull，2005，21(3):348 －50.

［5］朱伟，孙红光，朱迅.黄芩苷元对炎症反应的影响［J］.中国药理学通报，2009，25(2):194 －7.

［5］ Zhu W，Sun H G，Zhu X.Effects of baicalein on inflammation［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(2):194 －7.

［6］苏定冯，缪朝玉.神经系统药物实验方法［M］徐叔云，卞如濂，陈修，主编.药理实验方法学.第3版.北京:人民卫生出版社，2002:911－8.

［6］ Su D F，Miu C Y.The experimental methods of nervous system drugs［M］//Xu S Y，Bian R L，Chen X，Chief Ed.The methodology of pharmacological experiment［M］.3th ed Beijing:People＇s Sanitation Press，2002:911 －8.

［7］胡成穆，陈琳，李荣，等.豹皮樟总黄酮对免疫低下小鼠免疫功能的影响［J］.中国药理学通报，2007，23(6):804－8.

［7］ Hu C M，Chen L，Li R，et al.Immunomodulatory property of total flavonoids from Litsea corea-naleveille on immunosuppressive mice［J］.Chin Pharmacol Bulln，2007，23(6):804 －8.

［8］柏慧敏，张春燕，于文会.沙棘对大鼠非特异性免疫功能的影响［J］.中兽医医药杂志，2009，2:51－52.

［8］ Bo H M，Zhang C Y，Yu W H.The effect of hippophae rhamnoidesl on non-specific immune function of rats［J］.J Tradit Chin Veter Med，2009，2:51 －2.

［9］周日宝，童巧珍.灰毡毛忍冬与正品金银花的绿原酸含量比较［J］.中药材，2003，26(6):399.

［9］ Zhou R B，Tong Q Z.Comparative study on content of chlorogenic acid in lonicera japonica and L.macranthoides［J］.J Chin Med Mater，2003，26(6):399.

［10］ Gonthier M P，Verny M A，Besson C，et al.Chlorogenic acid bioavailability largely depends on its metabolism by the gut microflora in rats［J］.J Nutr，2003，133(6):1853 －9.