大鼠海马损毁与学习记忆研究进展

黄晓科 银晓勇 黄艳秋 李艳君 (河北省峰峰集团邯郸医院，河北 邯郸 056002)

海马是边缘系统重要组成部分，参与了情绪、学习和记忆、行为、免疫等的调节，目前发现成年海马神经发生可能有几种潜在的功能，包括学习和记忆的适应作用、对新环境的适应、与低沉情绪的潜在联系以及对损伤的可能反应〔1〕。海马结构和功能的研究是当前脑科学领域研究的热点，损毁法是研究脑海马功能定位的常用方法之一。

目前海马毁损的实验动物模型的滞后制约了海马的研究，随着海马损毁模型的完善，我们将能够越来越好地研究海马与认知的关系。已有的毁损海马模型，总的来说，包括物理损毁，化学损毁和电损毁。

1 物理方法

1.1 切断开穹窿海马伞通路 早在1954年，Daitz等人就采用横断穹窿海马伞系统来研究观察神经元的退化过程。后来人们为了进行AD方面的研究，采取了真空抽吸、横断或电解等方法损毁单侧或双侧穹窿海马伞通路建立AD模型〔2，3〕。此种方法主要是通过切断隔海马通路(如扣带束、背穹窿海马伞)，破坏胆碱能及非胆碱能纤维传入，导致实验动物行为及神经化学方面的缺损，造成动物空间定向和记忆障碍及胆碱能神经元的丢失。步骤:将大鼠用以10%水合氯醛3.5 ml/kg剂量，对实验大鼠行腹腔注射将其麻醉后，固定于脑立体定位仪，常规消毒、剪毛，正中切开头皮，暴露出颅骨，于前囟自后1.5 mm，中线外左右1.0 mm处，用电动开颅器凿开颅骨，切开硬脑膜，用自制的双刃刀先置于上述部位的脑表面(相当于弯窿部位)，续降刀6 mm，切断弯窿，降刀时间约1 min，假手术组降刀2 mm，(未切弯窿)，刀在脑中均停留5 min。清洁颅面，缝合头皮。用此方法建立模型，周期短(约2 w)，但手术定位难以控制，很难避免手术区邻近组织的受损。

胡谋先等〔4〕用手术的方法直接横切大鼠双侧隔一海马通路。腹腔麻醉大鼠，固定于脑立体定位仪上，用一把三面有刃的特制刀片在前囟后1.8 mm、距中线1 mm，自颅骨表面垂直插入5 mm横切距离4 mm切断双侧海马伞及部分穿隆。术后大鼠记忆力显著下降。He等〔5〕采用单侧弯窿伞损伤，主要破坏胆碱能通路，致使其中枢神经系统的完整性破坏，海马胆碱能纤维减少，大鼠学习记忆力下降。

1.2 液压打击 液压损伤法(FPI)由Lindgren于1966年首先报道，1976年使用于猫及兔正中液压打击，1987年 Dixon等〔6，7〕建立了大鼠液压冲击颅脑损伤模型。至1989年改进为啮鼠动物单侧半球液压冲击〔8，9〕。侧方液压冲击模型在2002年后广泛用于小动物TBI模型的制备。其原理是通过液压装置有然改变密闭颅腔内压力而间接造成脑损伤。根据颅骨钻孔的位置不同，可将模型分为正中冲击和侧位冲击两种。该法受外界因素如动物头颅发育的差异影响小，稳定性和重复性好，定性及可控性较强。

海马损伤模型的建立参照大鼠脑立体定位图谱明确海马结构对应脑皮层位置(海马结构基本位于前囟后1.8～6.0 mm，中线旁0.5～5 mm范围内皮层下)，确定于顶骨开骨窗部位。以10%水合氯醛3.5 ml/kg剂量，对实验大鼠行腹腔注射，常规备皮、消毒，顶部正中切口，分离暴露顶骨。选择前囟后3.5 mm，矢状缝右侧3 mm处钻孔开骨窗，骨窗直径为3 mm，注意保持硬脑膜的完整性。连接固定颅骨连接管，封闭液压打击系统。待大鼠恢复角膜反射及夹尾反射后再进行液压打击。此模型借助国际上通用的MODEL01-B液压打击装置对大鼠进行分组打击。

缺点:冲击后装置内压力不能立即释放，脑组织可再次受损伤，伴有不同程度局部脑挫伤的弥漫性脑损伤，挫伤范围及周围水肿程度随打击力度增加而增大。如果想对海马结构进行有效打击，则液压打击部位的选择和打击力度的控制尤为重要。如不加以重视，则会对海马以外脑组织造成较大范围损伤，加重大鼠意识及运动功能等障碍，掩盖因海马结构损伤所致的学习记忆功能障碍，致使实验结果不准确。如果打击冲击道波和(或)经过鼠脑中线部位，甚至会对脑干、丘脑等重要结构造成直接损害，明显增加实验组大鼠的伤情和死亡率。

林云鹏〔10〕用改进的液压打击海马损伤模型观察大鼠伤后空间学习能力发现:各实验组大鼠均可见程度不同的MR影像特征、病理学特征改变;除轻型打击组外，水迷宫逃避潜伏期及游泳距离均与对照组间存在显著差异。

2 电损毁

近年来电毁损建立模型在实验研究中得到广泛应用。电毁损即用金属电极通过直流电在中枢神经系统内造成损伤，其机制是离子流能诱发细胞发生不可逆性代谢改变，最终导致细胞死亡。由阳极电流造成的损伤，无论在损伤的大小及形状上均易于重复，而且损伤的程度可以通过电流强度及通电时间进行调节〔11〕。

以水合氯醛(35 mg/kg)腹腔麻醉，麻醉生效时间3～5 min，麻醉生效后将常规备皮、消毒，顶部正中切口，分离暴露顶骨。选择前囟后3.5 mm，矢状缝两侧3 mm处钻孔开骨窗，骨窗直径为3 mm，注意保持硬脑膜的完整性，按《大鼠立体定位图谱》确定海马位置海马结构基本位于前囟后1.8～6.0 mm，中线旁0.5～5 mm范围内皮层下，用直流电阳极电解双侧海马。电解损毁的最大不足是损毁特异性不强，它不仅定位损毁神经元，同时也损毁输入纤维和过路纤维，往往导致损毁部位与损毁效应关系的不确定。

方崇仪〔12〕利用局部电解损伤双侧海马的腹前部、后部和背前部对大白鼠避暗行为的学习和记忆的影响，结果表明;局部损伤海马各部可以不同程度地阻碍这种行为模式的学习和记忆，其中以损伤腹前部最为严重，依次是损伤后部和背前部，但是对大白鼠避光嗜暗的本能没有影响。

方崇仪〔13〕利用广泛的电损毁双侧海马背部或腹部观察对大白鼠避暗行为的学习和记忆的影响。结果表明:广泛的双侧损毁海马背部或腹部，可明显阻碍大白鼠避暗行为的学习和记忆，尤以损毁腹部更为严重，但是对大白鼠避光嗜暗的本能和电防御反应的敏感性等均无影响。提示广泛的双侧损毁海马背部或腹部可能阻碍暗间成为电击“信号”的学习过程及其痕迹的保持，而海马腹前部可能与这些过程有更密切的关系。

3 化学毁损

1980 年Ben-An、1985年Sofroniew等分别报道用兴奋性神经毒氨基酸，如红藻氨酸(KA)、鹅膏蕈氨酸(IBD)、使君子氨酸(QUIS)、N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)注入大鼠 NBM，可以损毁大鼠NBM建立痴呆模型〔14～16〕。随后，国内外一些科研工作者采用上述方法建立了AD模型，并在此基础上进行了关于AD的一系列研究。1987年方崇仪等〔17〕利用KA损伤海马各区来观察海马结构与大白鼠避暗行为的学习和记忆关系。神经毒氨基酸可导致海马各区的胆碱能神经元变性和减少，继而引进相应胆碱能纤维减少，细胞变性与死亡，胆碱能的标志酶ChAT和AChE含量下降，学习记忆行为减退。因此，这种神经兴奋毒性氨基酸可作为脑内局部去神经元的工具药而用于研究〔18，19〕，使用神经兴奋毒性氨基酸，脑组织内微量注射可使注射部位神经元变性死亡，而通过注射部位的神经纤维却安然无恙。

实验大鼠以水合氯醛(35 mg/kg)腹腔麻醉，按《大鼠立体定位图谱》确定海马位置海马结构基本位于前囟后1.8～6.0 mm，中线旁0.5～5 mm范围内皮层下将大鼠固定在脑立体定位仪上，剪开头皮后用过氧化氢清洗创面，确定前囟平面为参考平面，按确定的坐标在脑颅上打孔，然后将进样器针头缓缓插入到预定部位使用海人酸或使君子氨酸双侧损毁。手术完成后，每实验动物肌肉注射1万单位庆大霉素。

兴奋性神经氨基酸能扩散到远离注射脑区，意外地损及易伤的神经元，干扰结果的分析，由于毒性太大，海马对兴奋性神经毒氨基酸的兴奋作用比较敏感，如果损毁剂量或位置不适当就很容易导致实验失败甚至实验动物的死亡。因此在损毁时要十分注意。但化学损毁如果工具药选择得当，其损毁作用是相当特异的。

方崇仪〔17〕利用KA损伤海马各区观察海马结构与大白鼠避暗行为的学习和记忆关系发现损毁两侧海马背部与背前部的锥体细胞，但是几乎无损于大白鼠避暗行为的学习和记忆。损毁海马的腹前部、腹部和后部的CA3和CA4区锥体细胞，避暗行为的学习和记忆受严重障碍。Hendelmenn等〔20〕发现KA注入海马内，选择地损及大白鼠的CA3锥体细胞，并障碍了大白鼠在辐射迷宫中的学习和记忆，其中单独损及海马前部或后部的障碍较轻，而同时损及海马前部和后部的最为严重。Sutherland等〔21〕报道了用KA损伤单侧海马CA3，CA4区锥体细胞，并不影响大白鼠在水中的空间定位学习，而双侧的损伤对其才有影响。

海马损毁对学习和记忆的影响结果表明，海马在认知过程中扮演重要的过程，海马不同的区域在认知过程中扮演不同的角色，不同区域在不同的认知中起的作用不同。海马是参与学习和记忆的，但并非参与任何学习任务的习得和记忆，有些类型的学习，海马并非是必需的;同时海马不同区域，其参与程度也并非完全相同。虽然海马在学习、记忆中的作用研究的时间最长，研究工作最多，然而，真正机制还有待研究。

1 Schaffer DV，Gage FH.Neurogenesis and neuroadaptation〔J〕.Neuromolecular Med，2004;5(1):1-10.

2 Gage FH，Bjorkund A，Stenevi U.Reinnervation of the partialely deafferented hippocampus by compensatory collateral sprouting from spared cholinergic and noradrenergic afferents〔J〕.Brain Res，1983;268:27-37.

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10 林云鹏.液压打击海马损伤模型的改进及大鼠伤后空间学习能力观察〔J〕. 天津医科大学学报，2009，15(4):599-602.

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12 方崇仪.海马结构与大白鼠避暗行为的学习和记忆局部电解损伤双侧海马的腹前部、后部和背前部对大白鼠避暗行为的学习和记忆的影响〔J〕.北京大学学报(自然科学版)，1986;18(6):96-104.

13 方崇仪，田联明，欧阳三，等.利用广泛的电损毁双侧海马背部或腹部观察对大白鼠避暗行为的学习和记忆的影响〔J〕.北京大学学报(自然科学版)，1985;17(1):81-9.

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21 Sutherland RJ，Whishaw IQ，Kolb B，et al.A behavioural analysis of spatial localization following electrolytic，kainate-or colchicine-induced damage to the hippocampal formation in the rat〔J〕.Behavioural Brain Res，1983;7(2):133-53.