益肾活血颗粒对大鼠前列腺增生模型影响的实验研究

张育军，侯俊明，雒向宁，柏鲁宁，方永军，张健康

(1.陕西中医学院临床医学院外科教研室，陕西中医学院中西医结合外科研究所，陕西咸阳712046;2.广州市中山大学附属第一医院泌尿外科，广东广州510080)

益肾活血颗粒由黄芪、山萸肉、怀牛膝、泽泻、地鳖虫、三棱等药物组成，为陕西中医学院泌尿外科治疗前列腺增生症(benign prostatic hyperplasia，BPH)的临床经验方，具有补肾益气、活血化瘀、通利水道之功效。为探讨其抗前列腺增生的可能机制，我们观察了益肾活血颗粒对前列腺增生动物模型的前列腺质量、病理形态及半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶3(Caspase-3)表达的影响，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料益肾活血颗粒由陕西中医学院附属医院制剂中心制备，批号:110201;丙酸睾酮注射液，25 mg/mL，2 mL/支，上海通用药业股份有限公司生产，批号:090501;非那雄胺片(保列治片)每片5mg，默沙东药厂生产，批号:305416。一抗:Caspase-3兔抗鼠抗体，购自北京中山生物技术有限公司。电子天平;双目光学显微镜;多媒体彩色病理图文分析系统。

1.2 动物清洁级SD大鼠，雄性，鼠龄10～12周，体质量200～240 g，由第四军医大学实验动物中心提供，证号SYXK(陕)2008-005。

1.3 实验方法雄性SD大鼠40只适应性喂养7 d，编号称质量，腹腔注射0.2%的戊巴比妥钠(1 mL/kg)麻醉，无菌手术摘除双侧睾丸，经一周恢复后随机分为4组:模型组、益肾活血颗粒大剂量组、益肾活血颗粒小剂量组、阳性对照组。各组大鼠在每天皮下注射丙酸睾酮0.005 g/kg的同时开始灌胃给药，益肾活血颗粒大剂量组和益肾活血颗粒小剂量组依次每天给予2.25、1.12 g/kg灌胃，阳性对照组给予非那雄胺片0.001 g/kg灌胃，模型组给予等体积的生理盐水灌胃，连续28 d，每周称体质量以调节给药用量。28 d后处死大鼠，摘取前列腺，称取前列腺湿质量，计算前列腺指数，常规HE染色观察，测定免疫组化［1-2］。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 前列腺指数(PI)PI=前列腺质量(mg)/大鼠体质量(g)。

1.4.2 Caspase-3测定通过免疫组化(PV二步法)检测前列腺组织中Caspase-3蛋白的表达。标本用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，脱蜡后滴加Caspase-3兔抗鼠抗体，湿盒内4℃过夜，复温后PBS洗涤3次。再以二抗工作液覆盖，湿盒内孵育，PBS洗片，DAB显色，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察结果。caspase 3表达于上皮细胞浆中，以胞浆内出现棕黄色颗粒、胞核内无着色为阳性染色细胞。以图像分析软件分析测定其灰度值。

1.4.3 前列腺病理形态各组标本行常规H.E染色，光镜下观察组织病理学变化。

1.5 统计学方法用SPSS 13.0软件进行统计分析，结果以(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用q检验。

2 结果

2.1 各组大鼠前列腺指数PI的影响益肾活血颗粒大、小剂量组和阳性对照组均能使大鼠前列腺质量减少，前列腺指数降低。3个治疗组抑制前列腺增生的效果较模型组明显(P＜0.05)。尤以益肾活血颗粒大剂量组效果最为显著(P＜0.01)。见表1。

表1 各组对实验大鼠前列腺指数PI的影响(±s，n=10)

表1 各组对实验大鼠前列腺指数PI的影响(±s，n=10)

注:与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与阳性对照组比较，△P＜0.05。

组别给药剂量/(g·kg－1)大鼠体质量/g前列腺质量/mgPI/(mg·g－1)318.5±24.42.41±0.307.57±0.85益肾活血颗粒组(大剂量)2.25320.0±21.51.45±0.18＊＊△4.53±0.52＊＊△益肾活血颗粒组(小剂量)1.12317.5±29.81.82±0.25*5.73±0.56*阳性对照组0.001316.3±25.51.68±0.17*5.41±0.72模型组－*

2.2 前列腺病理形态变化情况模型组镜下可见前列腺腺体排列密集，腺上皮明显增生，细胞为高柱状，多数腺上皮呈乳头状突入腔内，间质纤维和平滑肌增多。益肾活血颗粒大剂量组腺体数量明显减少，极少数呈乳头状突入腔内，上皮细胞大多呈单层柱状，间质纤维和平滑肌少量增生。小剂量组和阳性对照组腺体数量较少，部分呈乳头状突入腔内，上皮细胞呈单层柱状及高柱状，间质纤维和平滑肌较多。

2.3 各组前列腺上皮组织caspase-3表达比较益肾活血颗粒大、小剂量组及阳性对照组caspase-3表达均明显强于模型组。益肾活血颗粒大、小剂量组之间比较，差异有统计学意义(P＜0.01);益肾活血颗粒大剂量组caspase-3表达与阳性对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，益肾活血颗粒大剂量组caspase-3表达明显强于阳性对照组;益肾活血颗粒小剂量组与阳性对照组比较，益肾活血颗粒小剂量组caspase-3表达接近于阳性对照组，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 各组前列腺上皮组织caspase-3的表达(±s)

表2 各组前列腺上皮组织caspase-3的表达(±s)

注:灰度值指前列腺上皮组织中caspase-3表达阳性细胞染色深度，灰度值与caspase-3含量成反比，灰度值越小，染色越深，caspase-3含量越高。与模型组比较，＊＊P＜0.01;与阳性对照组比较，△P＞0.05，△△P＜0.01，与小剂量组比较，▲▲P＜0.01。

只灰度值模型组组别给药剂量/(g·kg－1)动物/－10157.28±6.36益肾活血颗粒组(大剂量)2.251089.53±5.37＊＊△△▲▲益肾活血颗粒组(小剂量)1.1210120.24±4.35＊＊△阳性对照组0.00110117.50±3.41＊＊

3 讨论

良性前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia，BPH)是老年男性最常见的疾病之一，50岁以上的男性约有一半会出现临床症状。增生的前列腺挤压尿道，导致一系列排尿障碍症状，如尿频尿急、尿流细弱、尿不尽等，严重影响患者的生活质量，不及时治疗会导致许多严重并发症(如急性尿潴留、膀胱结石、肾功能不全等)，甚至会危及患者的生命［3］。有关良性前列腺增生的发病机制，目前尚不完全明了。近几年，细胞凋亡在良性前列腺增生发病中的作用机制逐渐受到人们的重视，认为良性前列腺增生是由于细胞凋亡减少，增殖增加，凋亡与增殖失衡所导致［4］。半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶-3(Caspase-3)是细胞凋亡的下游关键酶，Caspase-3在良性前列腺增生上皮表达下降，而在良性前列腺增生基质中几乎不表达，其表达异常与良性前列腺增生发生密切相关［5-6］。研究发现，caspase家族广泛存在于细胞中，主要以酶原形式存在，一旦caspase被激活，细胞死亡将不可避免地出现。caspase-3是caspase家族中最重要的成员，大多数触发细胞凋亡的因素，最终都需要通过caspase-3介导的信号传导途径导致细胞凋亡［7-8］。因此，干预caspase-3的表达在研究良性前列腺增生的防治中具有非常重要的意义［9］。

前列腺增生症属中医学癃闭、淋证等范畴，肾虚血瘀为前列腺增生症的基本病机。中医学认为，本病乃因年老体弱，肾气亏虚，气化无力，瘀血停滞，或湿热互结，阻于膀胱，水道不通所致。治宜标本兼治，补肾益气为治本，软坚消瘀、清热利湿为治标。益肾活血颗粒以补肾益气、温阳利水、活血化瘀、软坚散结为原则组方，在我院临床应用中取得了较好的疗效。本实验结果显示，益肾活血颗粒能减小前列腺质量，降低前列腺指数。模型组大鼠前列腺指数明显高于其他组，而益肾活血颗粒大剂量组PI明显下降，镜下见间质结缔组织增生明显减少，说明益肾活血颗粒具有较强抑制良性前列腺增生的作用。同时本实验研究表明，模型组大鼠前列腺组织caspase-3表达明显降低，而益肾活血颗粒大、小剂量组、阳性对照组中caspase-3的表达则明显升高，益肾活血颗粒大剂量组caspase-3的表达也强于小剂量组和阳性对照组，益肾活血颗粒小剂量组caspase-3的表达强度接近阳性对照组，二者无显著性差异。作为阳性对照药的非那雄胺是治疗良性前列腺增生的一线推荐用药［10］，通过降低前列腺组织内双氢睾酮(DHT)浓度，间接降低进入细胞核促使细胞增殖的信号水平，导致抑制细胞内特异性生长因子及其受体的表达，从而抑制前列腺细胞的增生［11］。近年来国外学者Bozec等［12］发现了非那雄胺可通过激活caspases-3和caspases-6而引发caspase介导的细胞凋亡途径，增加前列腺细胞凋亡。本研究也证实了这一点，发现非那雄胺阳性对照组中caspase-3的表达强于模型组(P＜0.01)，与益肾活血颗粒小剂量组差异无统计学意义。

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