RP-HPLC 法同时测定忍冬不同变异类型花蕾中7种成分

2012-01-25张芳张永清于晓

中成药 2012年9期

张芳，张永清*，于晓

(1.山东中医药大学，山东济南250355;2.山东医药技师学院，山东泰安271016)

金银花为中医临床最常应用的药物之一，具有疏散风热、清热解毒的功效［1］，其来源为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花［2］。金银花年需求量在2 000万kg以上，为满足需求，在山东、河南、河北等地广泛种植，其中山东金银花已有300余年的栽培历史，经过长期的自然选择与人工选择，其植株形态出现了分化变异，形成了数量众多的变异类型［3-5］。这些变异类型表现在产量和质量上均有差异［6-7］。

金银花化学成分复杂，其主要成分包括酚酸类、黄酮类、挥发油、环烯醚萜类等［8-9］。近年来有关金银花的质量控制有采用高效液相色谱法同时测定金银花中几种药效成分的报道［10-12］，但同时测定的成分种类还相对较少，本实验采用反相-高效液相色谱法(RP-HPLC)同时测定金银花药材中2种有机酸类(绿原酸、咖啡酸)、4种黄酮类(芦丁、金丝桃苷、木犀草苷、槲皮素)、1种环烯醚萜类(马钱苷)，旨在为建立金银花药材质量的多成分综合评价体系奠定基础，并且对忍冬不同变异类型花蕾质量进行评价，为金银花优良变异类型的筛选、稳定并提高金银花药材质量奠定基础。

1 仪器、材料与试剂

1.1 仪器Agilent1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，配四元梯度泵，在线脱气机，Agilent VWD可变紫外检测器，ChemStation色谱数据工作站。

1.2 试剂对照品绿原酸(批号:110753-200413)、咖啡酸(批号:110885-200102)、木犀草苷(批号:111720-200905)、芦丁(批号:100080-200707)、马钱苷(批号:111640-200604)、金丝桃苷(批号:111521-200303)、槲皮素(批号:100081-200907)，均购自中国药品生物制品检定所。乙腈(色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司)，磷酸(分析纯，莱阳化工实验厂)，甲醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)。

1.3 材料山东中医药大学药用植物园忍冬种质资源圃中种植的5个不同变异类型，均为四年生植株，栽培管理措施一致。5个不同变异类型分别为①小毛花、②大毛花、③小鸡爪、④大麻叶和⑤米花子。于2009年5月，在植株盛花期，分别采集其大白期花蕾，于室内通风处阴干，粉碎，置于干燥器中备用。原药材经山东中医药大学张永清教授鉴定为忍冬科植物忍冬Lonicerae japonica Thunb.的干燥花蕾。

2 方法与结果

2.1 色谱条件Aglient TC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);采用梯度洗脱，流动相A为0.4%磷酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序为0～18 min，A为87%;18～30 min，A为85%;30～43 min，A为85%～80%;43～48 min，A为80%;48～50 min，A为80%～70%;50～55 min，A为70%;55～65 min，A为70%～50%;检测波长为0～16 min，240 nm;16～40 min，323 nm;40～65 min，355 nm;体积流量1.0 mL/min，柱温为30℃，进样量20 μL。在上述色谱条件下，对照品及样品的色谱图见图1。

图1 对照品(A)及样品(B)色谱图Fig.1 Chromatograms of referance snbstances(A)and sample(B)

2.2 对照品溶液的制备精密称取各对照品适量，用甲醇溶解制成质量浓度分别为绿原酸(0.56 mg/mL)、马钱苷(13.25 μg/mL)、咖啡酸(54 μg/mL)、芦丁(5.7 μg/mL)、金丝桃苷(5.8 μg/mL)、木犀草苷(21.5 μg/mL)、槲皮素(3.05 μg/mL)。

2.3 样品溶液的制备取忍冬不同变异类型花蕾细粉约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称质量，放置6 h，超声处理60 min，放冷，称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，以微孔滤膜(0.45 μm)滤过即得供试品溶液。

2.4 线性关系的考察分别精密吸取2.2项下对照品贮备液2、4、6、10、20、40 μL，按2.1项下色谱条件进样，以峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标，进行回归计算，得回归方程与线性关系见表1。

表1 回归方程与线性关系

2.5 精密度考察精密吸取混合对照品溶液20 μL，连续进样6次，测定并计算各测定成分峰面积的RSD，结果见表2。结果表明各测定成分的RSD＜3%，精密度良好。

表2 7种成分的精密度、稳定性及重复性考察(n=6)

2.6 重复性考察取同一变异类型(大毛花)样品6份各约1.0 g，精密称定，按照2.3项下制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，测定并计算各成分的RSD，结果见表2。结果表明RSD＜5%，方法重复性良好。

2.7 稳定性考察对变异类型2号(大毛花)的供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，测定并计算各成分峰面积的RSD，结果见表2。结果表明RSD＜5%，稳定性良好。

2.8 加样回收率实验精密称取已知含有量的忍冬花蕾(大毛花)粉末6份，每份约1.0 g，分别加入适量混合对照品，按2.3项下制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，结果见表3。

表3 7种成分的回收率(n=6)

2.9 样品测定精密称取忍冬不同变异类型的花蕾粉末1.0 g，按2.3项下方法制备供试品溶液。准确吸取20 μL进样，在上述色谱条件下进行测定，按外标一点法计算各供试品中相应成分的含有量。结果见表4。

表4 忍冬不同变异类型花蕾7种成分测定结果(n=3)

3 结果与讨论

3.1 提取溶剂的选择根据各测定成分的极性和溶解性，考察了采用甲醇、乙醇及50%甲醇的提取效果及所得溶液色谱峰的分离效果，结果表明，以采用50%甲醇提取所得干扰成分少，各色谱峰的分离效果好且对各测定成分提取效率高，故选用50%甲醇作为提取溶剂。

3.2 色谱条件的优选考察了不同梯度的乙腈－0.4%磷酸水溶液的洗脱效果，结果表明，以本实验所用洗脱方式分离效果最好。

［12］，绿原酸的特征吸收波长为217 nm，240 nm，327 nm;芦丁的特征吸收波长为254 nm和366 nm;木犀草苷的特征吸收波长为253 nm和355 nm;槲皮素的特征吸收波长为254 nm和368 nm。将马钱苷、咖啡酸、金丝桃苷单对照品分别进行紫外全波长扫描，发现马钱苷的特征吸收波长为240 nm;咖啡酸的特征吸收波长为254nm和323nm;金丝桃苷的特征吸收波长为215nm，257nm，359nm。考虑到测定时干扰峰最少，故采用如下波长条件:0～16 min，240 nm;16～40 min，323 nm;40～65 min，355 nm。

3.3 忍冬5个变异类型花蕾成分比较利用所建立的色谱条件对忍冬5个不同变异类型花蕾的7种主要成分进行了测定，结果表明，所测定不同样品中绿原酸含有量最高，其次为马钱苷和木犀草苷，槲皮素含有量最低。

《中国药典》(2010年版)规定，金银花中绿原酸含有量不得低于1.5%，木犀草苷含有量不得低于0.05%。所测定5个不同变异类型绿原酸均符合《中国药典》规定，且以大麻叶含有量(3.906 7%)最高，小毛花含有量(2.244 5%)最低;不同变异类型间木犀草苷含有量差异显著，以大毛花(0.082 5%)最高，米花子(0.040 9%)最低，达不到药典规定标准。不同变异类型间马钱苷含有量变异范围在0.040 9%～0.107 9%之间，且以小毛花最高，米花子最低，最高者是最低者含有量的2.6倍左右。其次，咖啡酸、芦丁、槲皮素的含有量，不同变异类型间均差异显著。

以上结果显示了金银花栽培过程中种质优选对于提高药材质量的重要性和必要性。

3.4 小结本实验采用RP-HPLC法同时金银花药材中绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、木犀草苷、槲皮素、马钱苷7种成分，方法简便快速，结果准确，可用于金银花的质量控制。

参考文献:

［1］黄西峰.金银花的研究概况及展望［J］.中国中药杂志，1997，22(4):247-249.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:205.

［3］张永清.山东金银花生产情况调查［J］.山东中医杂志，2000，19(10):621-624.

［4］周凤琴，张永清，张芳，等.山东金银花种质资源的调查研究［J］.山东中医杂志，2006，25(4):268-271.

［5］周凤琴，李佳，冉蓉，等.我国金银花主产区种质资源调查［J］.现代中药研究与实践，2010，24(3):21-25.

［6］冉蓉，孔庆悦，周凤琴，等.山东10个不同种质金银花木犀草苷的含量测定［J］.中华中医药学刊，2008，26(4):753-754.

［7］周凤琴，冉蓉，李佳，等.山东10个不同种质金银花中绿原酸含量及品质评价［J］.山东中医杂志，2007，26(7):478-479.

［8］周建玉.金银花中化学成分分析研究进展［J］.天津药学，2009，21(5):60-62.

［9］赵国玲，刘佳佳，林丹，等.金银花化学成分与药理研究进展［J］.中成药，2002，24(12):973-976.