生晒参乙醇提取物直接酶法转化及液质分析

喻春皓，吴洁

(1.淮阴工学院生命科学与化学工程学院生物中药与生物催化课题组，江苏淮安223002;2.南京大学淮安高新技术研究院，江苏淮安223005)

人参为五加科人参属植物人参Panax ginseng C.A.Meyer的干燥根，是具有4 000多年药用历史的名贵中药材，在中国、韩国、日本、朝鲜及其它亚洲国家被广泛用于滋补、保健和医疗。生晒参为一种商品人参，为人参根挖出后洗净晒干的产品。人参皂苷(ginseng saponins)是人参的主要活性成分，已确认的皂苷成分达30种之多，按其结构可分为四环三萜达玛烷型皂苷和五环三萜齐墩果酸型皂苷两个大类［1-3］。其中达玛烷型皂苷又分为原人参二醇型皂苷和原人参三醇型皂苷，人参皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、F2、Rg3、Rh2、CK、原人参二醇(protopanaxdiol，PPD)等为原人参二醇型皂苷，原人参三醇型皂苷主要有Re、Rg1、Rg2、F1、F3、Rf、20(S)-glc-Rf、Rh1、原人参三醇(protopanaxtriol，PPT)等，而人参皂苷R0为齐墩果酸型皂苷。现代药理研究表明，人参药材中存在的天然皂苷，如Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1等，口服时均为前药，不能直接吸收进入血液，而是在肠道菌群的生物催化转化作用下转化为次生皂苷Rg3、Rh2、CK、Rh1等，或者进一步转化为苷元PPD、PPT，方能进入血液参与药效的发挥［4］，抑制癌细胞转移，诱导肿瘤细胞凋亡，为极具开发前景的抗癌和抗肿瘤药物。

由于Rg3、Rh2、CK、Rh1等次生皂苷在人参药材中含有量非常低，甚或根本不含有，其制备方法备受关注，主要有化学降解和生物转化等制备方法。宋长春等［5］用国产西洋参茎叶总皂苷直接碱催化水解制备Rh1和Rh2。陈燕萍等［6］用20(S)-原人参二醇组皂苷碱催化、热回流制备Rh2。但化学法有污染环境、副产物多等诸多缺点。相比之下，生物酶法转化具有专一性、产物构象单一、产率高等优点。因此，本实验结合前期对人参茎叶总皂苷的酶法修饰的基础［7］之上，选用糖苷酶制剂对生晒参乙醇提取物进行酶法转化研究，并对转化产物进行液质分析。

1 材料

高效液相色谱仪Agilent 1100系列LC/MS液质联用系统(美国安捷伦科技有限公司)，包括四元梯度泵、在线脱气装置、自动进样器、DAD检测器、柱温箱、电喷雾接口、四极杆质谱、ChemStation色谱工作站、6300 Series Ion Trap LC/MS分析软件。

生晒参饮片购自安徽亳州药材市场，经淮阴工学院制药工程系张海江副教授鉴定为五加科人参属植物人参Panax ginseng的生晒干燥根。

人参皂苷R1、Rb1、Re、Rg1、Rg3、Rc、Rd、Rh2等皂苷对照品均购自金测分析技术(天津)有限公司，其纯度均为98%。纤维素酶(CE01)、果胶酶(PE05)、白酒酶(LE04)购自天津佳益酶制剂公司，纤维素酶(CE02)、果胶酶(PE06)、酸性淀粉酶(AE03)购自天津利华酶制剂公司，蜗牛酶(SE07)购自上海根生生物科技有限公司。色谱纯乙腈和冰乙酸均购自美国Tedia公司，纯水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 液相色谱和质谱分析条件色谱条件参考文献［7］并适当调整。色谱柱Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，保护柱Agilent Zorbax SB-C18(12.5 mm×4.6 mm，5 μm)，以1.0 mmol/L乙酸-乙腈溶液(A相)和1.0 mmol/L乙酸-水溶液(B相)为流动相，梯度洗脱(0～25 min，18%～30%A;25～40 min，30%～50%A;40～50 min，50%～70%A;50～60 min，70%～82%A;60～75 min，82%～100%A;75～77 min，100%～18%A;77～87 min，18%～18%A)，体积流量1 mL/min，DAD检测器，检测波长203 nm，柱温30℃，进样量10 μL。

采用负离子模式进行质谱分析，干燥氮气体积流量10 L/min，干燥温度350℃，喷雾气体氮气压力60 psi(1 psi=6.895 kPa)，毛细管电压3 500 V，扫描的质荷比范围100～1 400 m/z。

2.2 溶液制备

2.2.1 酶液的制备分别取7种固体酶制剂1.0 g，溶于10 mL 1.0 mmol/L pH 4.5磷酸缓冲液(其中含10%乙醇)，充分混匀，1 000 r/min低温离心，取上清液备用。

2.2.2 生晒参乙醇提取物的制备称取1.0 kg生晒参饮片，用6倍量70%乙醇提取3次，合并药液，趁热过滤处理，减压回流除去乙醇，浓缩至1.2L，再次过滤处理得滤液，并蒸气灭菌处理备用，用8倍量1.0 mmol/L pH 4.5磷酸缓冲液稀释，记为生晒参提取物SGE。

2.2.3 参比样品的制备准确取10 mL生晒参提取物SGE，加入1.0 mL磷酸缓冲液B，在180 r/min 37℃恒温水浴摇床中培养48 h，用11 mL水饱和的正丁醇萃取，取5 mL超纯水洗正丁醇相3次，80℃减压回收正丁醇至干得残渣，用10 mL甲醇充分溶解残渣，并经0.45 μm有机系滤膜过滤处理为HPLC分析备用，作为参比样品E00。

2.2.4 酶法转化样品的制备准确取10 mL生晒参提取物SGE，分别加入2.2.1项中的酶液1 mL，其余处理同2.2.3项，得系列酶法转化样品。

2.2.5 对照品皂苷溶液制备分别准确称取8种皂苷对照品，用甲醇配制成单标皂苷溶液，用作定性分析。准确称取8种皂苷对照品一同置于5 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至5 mL，经0.45 μm有机系滤膜过滤处理，其最终质量浓度为:NR1，0.543 5 mg/mL;Rb1，0.652 2 mg/mL;Rc，0.179 3 mg/mL;Rd，0.451 1 mg/mL;Re，0.157 6 mg/mL;Rg1，0.402 2 mg/mL;Rg3，0.141 3 mg/mL;Rh2，0.592 4 mg/mL。即得8种皂苷的混合对照品溶液，记为GMS混标溶液。

2.3 线性关系考察取2.2.5项中配制的GMS混标溶液，取0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、10、15 μL等不同的进样体积，按照2.2.1项中的色谱条件进行测定。以进样量对峰面积积分值进行回归处理，得8种皂苷的对照品曲线，见表1。

表1 8种皂苷活性成分的对照品曲线Tab.1 Standard curves of eight ginsenosides

2.4 方法学考察参考文献［7］，对所建立测定方法进行精密度、稳定性、重复性、加样回收率等考察分析，结果表明所测试项均符合要求。

2.5 数据处理单体皂苷含有量=样品溶液中各单体皂苷的质量/10 mL生晒参提取物相当的生晒参质量×100%。总含有量为样品中检出的Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd等5种皂苷含有量之和。总转化能力=(未加酶样品中皂苷总含量－转化样品中5种皂苷总含有量)/未加酶样品中皂苷总含有量×100%。

2.6 结果

2.6.1 不同糖苷酶制剂转化生晒参乙醇提取物的液相色谱分析按2.2.4项制备样品，考察不同糖苷酶制剂对生晒参乙醇提取物的转化影响，结果见图1，其主要特征色谱峰面积变化见表2。7种酶制剂对8种皂苷的含有量变化影响见表3，其中6种糖苷酶制剂的总转化能力顺序为SE07=PE05＞PE06＞LE04＞CE02＞CE01，而AE03转化时因提取物中的其它皂苷被转化成Rc和Rd使得计算的5种皂苷总含有量高于未加酶样。其中蜗牛酶SE07对生晒参乙醇提取物中天然皂苷的转化作用较强，转化生成了系列新化合物。

图1 糖苷酶制剂转化生晒参乙醇提取物后的色谱图谱比较Fig.1 HPLC chromatograph of alcohol extracts from sun-dried Panax ginseng converted with glycosidase

2.6.2 液质联用法色谱峰指认采用负离子模式［8-10］按2.1项对蜗牛酶SE07转化样品进行液质联用分析，并与未加酶样品(E00)及混标溶液(GMS)的液质分析图谱比较，对各保留时间下物质峰进行指认，结果见表4。

3 讨论

本实验通过HPLC分析比较了7种糖苷酶制剂对生晒参乙醇提取物中天然皂苷成分的转化能力，与未加酶样品比较7种糖苷酶制剂对生晒参乙醇提取物中的天然皂苷成分均有一定的转化作用，但各有侧重。与对照品比对分析，生晒参乙醇提取物经纤维素酶CE01、CE02及酸性淀粉酶AE03催化反应48 h后，Rb1和Rc分子上1，6-糖苷键均可被催化水解转化为Rd。经白酒酶LE04、果胶酶PE05和PE06、蜗牛酶SE07催化反应48 h后，可催化水解Rb1和Rc分子中的1，6-糖苷键转化成Rd，也可催化水解Rd中的糖苷键，均在Rh2峰紧邻处产生了一个强峰，其中酶PE05和SE07对Rb1转化较为彻底。由表3和4可知，生晒参乙醇提取物经蜗牛酶处理后，与未经酶处理相比，Rb1消失殆尽，Rc和Rd均降低，而在保留时间41.6 min和50.9 min分别产生了与Rg3(783［M－H］－1)和Rh2(621［M－H］－1)的同分异构体。文献［11］数据比对分析表明，HPLC及LC/MS分析保留时间为41.6 min和50.9 min分别为人参皂苷F2(783［M－H］－1)和CK(621［M－H］－1)。可推测生晒参中天然皂

苷Rb1和Rc的酶法转化途径为，Rb1或Rc→Rd→F2→CK。

表2 糖苷酶制剂对生晒参乙醇提取物转化液的液相色谱特征峰面积的影响Tab.2 Effects of glycosidase on peak area of active components in converted solutions

表3 糖苷酶制剂对生晒参乙醇提取物转化液中8种皂苷的影响Tab.3 Effects of glycosidase on concentration of eight ginsenosides in converted solutions

表4 混标溶液(GMS)、未加酶(E00)及蜗牛酶(SE07)转化样品的液质分析及峰指认Tab.4 HPLC-UV-ESI-MS identification results of GMS，sample E00 and SE07

天然人参皂苷的转化方法主要有化学转化、微生物转化、酶法转化等方法［12］。酸水解转化有完全水解和部分水解，但皂苷的C-20位的构型极易受酸的影响转位，发生互变异构现象，结果造成次生皂苷活性降低。和酸水解比较，碱水解中间产物较少，水解比较完全，C-20位异构化程度低，但规模化生产的环境污染严重。微生物转化的反应条件相对要求较高，其规模化扩大上可控性要求会更高。酶法转化为选择性水解反应，不同种类的酶可作用于不同构型和不同的糖苷键，可达到定向水解的目的。某些高活性特殊次生皂苷(如CK)分子很难通过化学转化法获得，而通过酶法转化较为容易，体现了酶法转化的专一性、高选择性的优点。本实验采用的糖苷酶制剂是多种酶的混合物，因此对生晒参乙醇提取中天然皂苷就够会有不同的选择性。该研究结果为利用酶制剂直接转化生晒参乙醇提取物制备高活性次生皂苷提供可靠的依据，具有较高的利用前景。

［1］Dou D Q，Ling J，Chen Y J.Advances and prospects of the study on chemical constituents and pharmacological activities of Panax ginseng［J］.J shenyang Pharm Univ，1999，16(2):151-156.

［2］Dou D Q，Wen Y，Pei Y P，et al.A new minor saponin from leaves of Panax ginseng［J］.Plant Med，1996，62:179-181.

［3］Kim D S，Cheng Y J，Zedk U.Dammarane saponins from Panax ginseng［J］.Phyotochem，1995，40(5):1493-1497.

［4］Shibata S.Chemistry and cancer preventing activities of ginseng saponins and some related triterpenoid compounds［J］.J Korean Med Sci，2001 16(Suppl):S28-37.

［5］宋长春，马兴元，徐景达.用西洋参茎叶总皂苷制备人参皂苷Rh1和Rh2［J］.中国药学杂志，1992，27(1):6.

［6］陈燕萍，孟勤，宋长春，等.20(S)-原人参二醇组皂苷的制备及其转化制取人参皂苷Rh2［J］.中国药学杂志，1997，32(5):273-275.

［7］喻春皓，魏峰，何志敏.酶法修饰人参茎叶总皂苷及其HPLC图谱研究.中草药，2007，38(1):46-50.

［8］章弘扬，胡坪，梁琼麟，等.结合两种LC/MS方法用于复方丹参滴丸中多成分的鉴定［J］.中成药，2009，31(1):60-64.

［9］张海江，蔡小军，程翼宇.高效液相色谱-电喷雾质谱法鉴别人参、西洋参和三七的皂苷提取物［J］.中国药学杂志，2006，41(5):391-394.

［10］刘燕，聂黎行，陈方军，等.高分离度快速液相色谱-离子阱质谱分析参麦注射液化学成分［J］.药物分析杂志，2011，31(9):1672-1677.

［11］姜彬慧，韩颖，赵余庆，等.酶转化三七叶总皂苷制备人参皂苷C-K的工艺优化［J］.中草药，2004，35(9):986-988.

［12］侯金刚，李伟，郑毅男.酶解法转化人参皂苷Rh1及其含量测定［J］.中国中药杂志，2009，34(23):3030-3033.