参葛颗粒质量标准研究

2012-01-25骆慧琳谢燕李国文张彤高月求

中成药 2012年9期

骆慧琳，谢燕*，李国文，张彤，高月求

(1.上海中医药大学，上海201203;2.上海中医药大学附属曙光医院，上海201203)

参葛颗粒是由丹参、葛根、片姜黄等六味中药组成的中药复方制剂，具有健脾祛湿，化瘀消痰的功效，药理实验和临床研究［1］表明对非酒精性脂肪肝病(Alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)有较好的疗效。为了控制该制剂的质量，保证临床用药安全有效，通过实验研究及调阅文献［2-4］，采用薄层色谱鉴别方法对女贞子、片姜黄、葛根、丹参进行定性鉴别，以葛根中葛根素和丹参中丹酚酸B作为定量测定的指标成分，并建立定量测定方法，所建立的方法能客观反映参葛颗粒的品质，对其质量进行有效控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器Agilent 1100高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司);Kromasil 100-5C18色谱柱(AKZO NOBEL公司);CAMAG ATS4全自动点样仪、CAMAG Reprostar 3数码成像系统(瑞士卡玛公司);Sartorius CPA225D电子天平(赛多利斯公司)。

1.2 试药参葛颗粒(自制，批号:110901、110902、110903)，齐墩果酸对照品(批号:110709-200505)，片姜黄对照药材(批号:121006-200903)，丹参对照药材(批号:120923-200912)，葛根对照药材(批号:121551-200902)，葛根素对照品(批号:110752-200912)，丹酚酸B对照品(批号:111562-200908)均购于中国药品生物制品检定所。硅胶G、GF254(青岛海洋化工厂分厂)，甲醇(色谱级，霍尼韦尔公司)，纯化水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 女贞子薄层鉴别取本品研至细粉状，称取4 g，加50 mL三氯甲烷，超声30 min，抽滤，滤液至蒸发皿中低温蒸发有机溶剂至干，残渣加1 mL甲醇溶解，离心，取上层溶液作为供试品溶液。再取按处方比例及工艺制备的缺女贞子阴性对照样品8 g，按上述方法和步骤制成阴性对照溶液;另取适量的齐墩果酸对照品，至10 mL量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，制成1 mg/mL的齐墩果酸对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述溶液各4 μL，用全自动点样仪点于同一硅胶G薄层板上使成条带状，把环己烷-丙酮-乙酸乙酯(5∶2∶1)作为展开剂［5］，展开至前沿线，取出，晾干后均匀喷洒10%硫酸乙醇溶液，置加热板上105℃加热至斑点显色清晰，于紫外灯366 nm下观察荧光，结果见图1。阴性对照未见干扰，而供试品与齐墩果酸在相应的位置上，显示相同颜色的荧光斑点。

图1 女贞子薄层色谱图Fig.1 TLC chromatogram of Ligustri lucidi Fructus

2.1.2 片姜黄薄层鉴别［6］取本品研至细粉状，称取4 g，加20 mL水超声10 min，滤过，滤液用石油醚(30～60℃)萃取3次，每次20 mL，合并石油醚层，浓缩至0.5 mL，作为供试品溶液。再取按处方比例及工艺制备的缺片姜黄阴性对照样品4 g，按上述方法和步骤制成阴性对照溶液;另取0.4 g片姜黄对照药材，加2 mL石油醚(30～60℃)，超声30 min，离心，取上清液，浓缩至0.5 mL，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液、对照药材溶液1 μL、2 μL、2 μL，用全自动点样仪分别点于同一硅胶G薄层板上使成条带状，把石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯(17∶3)作为展开剂，展开至前沿线，取出，晾干后均匀喷洒5%香草醛硫酸溶液显色，置加热板上100℃加热至斑点清晰，白光下检视，结果见图2。阴性对照未见干扰，而供试品与对照药材在相应的位置上，显示相同颜色的斑点。

2.1.3 葛根薄层鉴别取本品研至细粉状，称取0.1 g，加50 mL 25%甲醇超声30 min，滤过，水浴蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，离心，弃去沉淀，取上层液体作为供试品溶液。再取按处方比例及工艺制备的缺葛根阴性样品0.1 g，按上述方法和步骤制成阴性对照溶液;另取0.2 g葛根对照药材，同上述处理制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述溶液各1 μL，用全自动点样仪分别点于同一硅胶G薄层板上使成条带状，把环己烷-丙酮-乙酸乙酯(5∶2∶1)作为展开剂，展开至前沿线，取出，晾干，用氨水熏10 min［7-8］，在紫外灯254 nm下观察荧光，结果见图3。阴性对照未见干扰，而供试品与对照药材在相应的位置上，显示相同颜色的荧光斑点。

图2 片姜黄薄层色谱图Fig.2 TLC chromatogram of Wenyujin Rhizoma Concisum

图3 葛根薄层色谱图Fig.3 TLC chromatogram of Puerariae lobatae Radix

2.1.4 丹参薄层鉴别取本品研至细粉状，称取0.2 g，加50 mL 25%甲醇超声30 min，滤过，水浴蒸干，残渣用1 mL甲醇溶解，离心，弃去沉淀，取上层液体作为供试品溶液。再取按处方比例及工艺制备的缺丹参阴性样品0.2 g，按上述方法和步骤制成阴性对照溶液;另取0.2 g丹参对照药材，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录VIB)试验，吸取上述溶液各3 μL，用自动点样仪分别点于同一硅胶GF254薄层板上使成条带状，把甲苯-乙酸乙酯-甲酸(8∶5∶0.8)作为展开剂［9］，展开至前沿线，取出，晾干后在紫外灯366 nm下观察荧光，结果见图4。阴性对照未见干扰，而供试品与对照药材在相应的位置上，显示相同颜色的荧光斑点。

图4 丹参薄层色谱图Fig.4 TLC chromatogram of Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma

2.2 定量测定

2.2.1 葛根素

2.2.1.1 色谱条件Kromasil-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm);以甲醇-水(25∶75)为流动相;检测波长为250 nm［10］。理论板数按葛根素峰计算应不低于4 000［11］。

2.2.1.2 对照品溶液的制备取适量葛根素对照品，精密称定，加甲醇制成每1 mL含葛根素100 μg的溶液。

2.2.1.3 供试品溶液的制备取本品粉末约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 25%甲醇，密塞，称定质量，超声10 min，放冷后再称定质量，用25%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.1.4 线性关系考察取适量葛根素对照品精密称定后置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，以25%甲醇逐级稀释，分别得到质量浓度为1.82、4.56、9.12、22.81、38.02、47.52 μg/mL的对照品溶液。精密吸取上述葛根素对照品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，按2.2.1.1项下色谱条件测定，以葛根素质量浓度(X)为横坐标，以峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=43.365X－15.474，r=0.999 8。结果表明葛根素进样量在0.018～0.480 μg范围内与峰面积的线性关系良好。

2.2.1.5 稳定性试验取同一供试品溶液，分别于配制后0、1、2、4、8、12 h重复进样测定。以葛根素峰面积计算，RSD为0.87%，表明供试品溶液在室温下放置12 h基本稳定。

2.2.1.6 重复性试验取同一批号供试品6份，按照正文定量测定方法操作并测定，其含有量的RSD为0.32%，表明本方法重复性较好。

2.2.1.7 精密度试验精密吸取同一对照品溶液(质量浓度为21.50 μg/mL)10 μL，相同条件下重复进样6次，求得葛根素峰面积的RSD为0.56%，结果表明该仪器有良好的精密度。

2.2.1.8 回收率试验精密称取已知葛根素含有量的同一批号样品9份，按相当于参葛颗粒中葛根素量的80%、100%、120%(即低、中、高剂量组)加入葛根素对照品溶液，按2.2.1.3项下方法制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪，依法测定，计算回收率。结果见表1。葛根素的平均回收率为103.17%，RSD为2.43%。

表1 葛根素回收率测定结果Tab.1 Results of recovery tests

2.2.1.9 空白试验按照处方的组成和比例，取除葛根以外的其余药味并按照工艺条件制成缺葛根的供试品。按2.2.1.3项下的方法制备成阴性样品溶液。取阴性样品溶液10 μL，按照2.2.1.1项下进行测定，色谱图在葛根素相应的保留时间处没有色谱峰，说明阴性样品溶液无干扰。见图5。

2.2.1.10 样品测定取3批参葛颗粒(批号110901、110902、110903)适量，按2.2.1.3项下方法制备样品，以葛根素对照品质量浓度为横坐标(X)，相应的色谱峰峰面积为纵坐标(Y)，绘制随行标准曲线，测得样品的峰面积代入随行标准曲线，计算葛根素含量。按2.2.1.1项下色谱条件进行含量测定，结果见表2。

图5 葛根素对照品溶液(A)、供试品溶液(B)和阴性样品溶液(C)HPLC色谱图Fig.5 HPLC chromatograms of puerarin reference substance(A)，granules sample(B)and negative sample(C)

表2 参葛颗粒中葛根素的测定结果(n=3)Tab.2 DeterminationresultsofpuerarininShenge Granules(n=3)

2.2.2 丹酚酸B

2.2.2.1 色谱条件Kromasil-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm);以甲醇-乙腈-1.67%甲酸水溶液(27∶10∶63)为流动相;检测波长为286 nm。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于2 000［11］。

2.2.2.2 对照品溶液的制备取适量丹酚酸B对照品，精密称定，加甲醇制成每1 mL含丹酚酸B 40 μg的溶液。

2.2.2.3 供试品溶液制备取本品粉末约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 25%甲醇，密塞，称定质量，超声10 min，放冷后再称定质量，用25%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2.4 线性关系考察取适量丹酚酸B对照品精密称定后置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，以25%甲醇逐级稀释，分别得到质量浓度为201.49、80.60、50.37、30.22、15.11、9.07 μg/mL的对照品溶液。精密吸取上述葛根素对照品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，按2.2.2.1项下色谱条件测定，以丹酚酸B质量浓度(X)为横坐标，以峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=596.13X－6.350 1，r=0.999 9。结果表明丹酚酸B进样量在0.091～2.015 μg范围内与峰面积的线性关系良好。

2.2.2.5 稳定性试验取同一供试品溶液，分别于配制后0、1、2、4、8、12 h重复进样测定。以丹酚酸B峰面积计算，RSD为1.25%，表明供试品溶液在室温下放置12 h基本稳定。

2.2.2.6 重复性试验取同一批号供试品6份，按照正文定量测定方法操作并测定，其含有量的RSD为0.71%，表明本方法重复性较好。

2.2.2.7 精密度试验精密吸取同一对照品溶液(质量浓度为40.35 μg/mL)10 μL，相同条件下重复进样6次，求得丹酚酸B峰面积的RSD为0.51%，结果表明该仪器有良好的精密度。

2.2.2.8 回收率试验精密称取已知葛根素含有量的同一批号样品9份，按相当于参葛颗粒中丹酚酸B量的80%、100%、120%(即低、中、高剂量组)加入丹酚酸B对照品溶液，按2.2.2.3项下方法制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪依法测定，计算回收率。结果见表3。丹酚酸B的平均回收率为101.38%，RSD为2.83%。

表3 丹酚酸B回收率测定结果Tab.3 Results of recovery tests of salvianolic B

2.2.2.9 空白试验按照处方的组成和比例，取除丹参以外的其余药味并按照工艺条件制成缺丹参的供试品。按2.2.2.3项下的方法制备成阴性样品溶液。取阴性样品溶液10 μL，按照2.2.2.1项下进行测定，色谱图在丹酚酸B相应的保留时间处没有色谱峰，说明阴性样品溶液无干扰。见图6。

图6 丹酚酸B对照品溶液(A)、供试品溶液(B)和阴性样品溶液(C)HPLC色谱图Fig.6 HPLC chromatograms of salvianolic acid B re-ference substance(A)，granules sample(B)and negative reference(C)

2.2.2.10 样品测定取3批参葛颗粒(批号110901、110902、110903)适量，按2.2.2.3项下方法制备样品，按2.2.2.1项下色谱条件进行含有量测定，以丹酚酸B对照品质量浓度为横坐标(X)，相应的色谱峰峰面积为纵坐标(Y)，绘制随行标准曲线，测得样品峰面积代入随行标准曲线，

计算丹酚酸B含量。结果见表4。

表4 参葛颗粒中丹酚酸B的测定结果(n=3)Tab.4 Determination results of salvianolic acid B in Shenge Granules(n=3)

3 讨论

在对片姜黄进行薄层鉴别中，供试品的处理方法曾经尝试直接用石油醚(30～60℃)提取，但供试品溶液的斑点与对照药材未能很好的对应，考虑到片姜黄的主要成分——挥发油可能由于经过β-环糊精包合，在有机溶剂中很难被提取出来，所以采用先以水提取后再以石油醚(30～60℃)萃取的方法处理样品，结果斑点对应一致。

在葛根的薄层鉴别中，展开晾干后若立即在紫外灯254 nm下观察，斑点很不明显，需放置1～3 h才能使斑点清晰，后改用氨水熏蒸，只需10 min就可使斑点显现。

在参葛方中，丹参为君药，葛根为臣药。丹参中的丹酚酸B具有抑制脂质过氧化反应及抗肝纤维化作用，其机制可能为丹酚酸B能清除氧自由基、抑制脂质过氧化反应，减少MDA的产生，从而减少肝细胞的损伤，抑制TGF-β的产生和HSC的增殖活化，具有抗肝纤维化作用［12］。葛根中的葛根素能明显防治实验性大鼠NAFLD，与辛伐他汀相比，葛根素能更高好地减轻脂类在肝脏中的积聚、降低炎症反应、保护肝细胞［13］，两者分别被2010年版《中国药典》一部定为控制丹参、葛根质量的目标成分。故选择丹参中的丹酚酸B和葛根中的葛根素作为控制本品质量的定量指标。

该质量控制方法简便可靠、精密度高、分离效果好，可用于参葛颗粒的质量控制。

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