LC-MS/MS 测定正骨水中3种乌头类生物碱的方法研究

刘吉成，周嵩煜

(1.广西玉林食品药品检验所，广西玉林537000;2.广西南宁食品药品检验所，广西南宁530001)

正骨水由九龙川、木香、海风藤、草乌等二十六味中药提取而成，具有活血祛瘀，舒筋活络，消肿止痛之功效，用于跌打扭伤，骨折脱位以及体育运动前后消除疲劳等［1］;因其中草乌药材含有乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等酯型生物碱成分，这些生物碱既是有效成分又是毒性成分，药材的炮制方法和产地及采收时间不同，其毒性成分量差异较大［2-3］，使用中若有不慎即可引起中毒，甚至死亡［4］。目前对含有乌头类药材的中成药研究中，多数仅控制了乌头碱的限度［5］，但该类药物中还含有次乌头碱和新乌头碱也属于双酯型生物碱，应与乌头碱一起加以控制。由于正骨水远销新加坡、马来西亚等东盟各国，在一些国家进出口过程中要求提供乌头类生物碱的检测方法和限度标准，由于《中国药典》2010年版一部中没有这方面的规定，本试验采用LC-MS/MS测定正骨水中的乌头碱、次乌头碱和新乌头碱，方法专属性强，结果准确可靠，能够对正骨水提供有效的质量评价和质量控制。

1 仪器和试剂

1.1 仪器Waters2695高效液相-Quattro MicroTMAPI质谱联用仪(美国Waters公司);LC/MS20-1氮气发生器(英国Domnick hunter公司);K280R高速冷冻离心机(英国森特恩);Hei-VAPA旋转蒸发器(Heidolph公司);XS-205DU电子分析天平(梅特勒-托利多)。

1.2 标准物质和试剂乙腈、正己烷、甲酸为色谱纯，水为超纯水，乙醚，氨水等均为分析纯。乌头碱、次乌头碱及新乌头碱对照品均购自中国药品生物制品检定所，批号分别为:110720-200410，110798-200404，0799-9403;正骨水由广西玉林制药有限公司提供，批号为:20110117、211174、211175、211233。

2 方法与结果

2.1 色谱条件［3，6］XTerraMS®C18色谱柱，5 μm，2.1 mm×150 mm，柱温35℃，体积流量0.25 mL/min，流动相为乙腈-10 mmol/L醋酸胺(含0.1%甲酸)(35∶65)，进样量20 μL。在上述条件下对照品3种成分各定量离子的色谱图见图1。

图1 3种乌头类生物碱对照品溶液MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of the three kinds of aconitine alkaloids in standard solution

2.2 质谱条件［6-8］电喷雾离子源(ESI)，正离子模式，采集方式为多反应监测(MRM);毛细管电压1.8 kV;离子源温度120℃;脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气氮气体积流量为850 L/h;锥孔氮气体积流量为100 L/h;碰撞气为氩气，质量分析器为四级杆;定性离子对，定量离子对、锥孔电压及碰撞能量见表1。

2.3 供试品溶液的制备［9-12］精密量取本品50 mL，置100 mL平底烧瓶中，在40℃水浴减压旋转蒸发，剩余液体约10 mL转移到50 mL具塞离心管中，用氨水5 mL洗涤平底烧瓶，洗涤液体一并转入50 mL具塞离心管中，加15 mL乙醚洗涤平底烧瓶，一并转入50 mL具塞离心管中，涡旋振摇提取1 min，6 000r/min离心10min，把乙醚层转移到100 mL平底烧瓶中，反复用乙醚提取3次，每次15 mL，合并乙醚液至100 mL平底烧瓶中，于35℃水浴减压旋转蒸干乙醚，残渣精密加入5 mL1%甲酸，2 mL正己烷，超声2 min，转移到10 mL离心管中，涡旋振摇，离心，取下层水相过滤即得，供试品图谱见图2。

表1 3种乌头类生物碱质谱条件参数Tab.1 Mass spectreometry parametres of the three kinds of aconitine alkaloids

图2 供试品溶液中3种乌头类生物碱MRM色谱图Fig.2 MRM chromatograms of the three kinds of aconitine alkaloids in sample solution

2.4 对照品溶液的制备取乌头碱对照品11.40 mg、次乌头碱13.28 mg、新乌头碱9.95 mg各置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，再分别精密量取1 mL，置同一100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度作为混合对照品贮备液。

2.5 线性关系考察精密量取混合对照品贮备液0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mL，分别置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，进样，以质量浓度为横坐标，定量离子峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到乌头碱、次乌头碱和新乌头碱的标准曲线方程分别为:乌头碱:Y=47.374 2X－0.136 0(r=0.999 97);次乌头碱:Y=78.384 6X－23.14(r=0.999 93);新乌头碱:Y=66.887 4X－16.69(r=0.999 70)。结果表明乌头碱在1.14～57.0 ng/mL、次乌头碱在1.328～66.40 ng/mL，新乌头碱在0.995～49.75 ng/mL范围线性关系良好。

2.6 专属性试验取不加草乌制备的供试品溶液，按照上述2.3项下供试品处理过程处理，制备空白供试品溶液，结果空白样品中没有检测到乌头碱、次乌头碱和新乌头碱，图谱见图3。

图3 阴性供试品MRM色谱图Fig.3 MRM chromatograms of negative samples

2.7 精密度试验取含乌头碱质量浓度为22.80 ng/mL，次乌头碱质量浓度为26.56 ng/mL和新乌头碱质量浓度为19.90 ng/mL的混合对照品溶液，进样20 μL，连续进样6针，记录定量离子的峰面积，乌头碱、次乌头碱和新乌头碱的RSD分别为1.8%、2.3%和2.2%。

2.8 重复性试验取本品(批号:211233)共6份，按照2.3项下方法制备供试品溶液，进样分析，计算质量浓度和RSD值，乌头碱的质量浓度为0.095 ng/mL，RSD为3.6%;次乌头碱的质量浓度为1.064 ng/mL，RSD为2.1%和新乌头碱的质量浓度为0.090 ng/mL，RSD为3.0%。

2.9 稳定性试验取重复性试验项下样品，分别于0、3、6、10、15、24 h进样分析，记录定量离子峰面积，乌头碱、次乌头碱和新乌头碱的RSD分别为2.3%、1.3%和1.8%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.10 加样回收试验分别精密量取含乌头碱对照品质量浓度为114 ng/mL溶液0.05 mL，含次乌头碱132.8 ng/mL溶液0.5 mL，含新乌头碱99.5 ng/mL溶液0.05 mL，置100 mL平底烧瓶，用氮气吹至近干，再精密量取供试品溶液50 mL(批号:211233)，按照2.3项下制备成供试品溶液，进行加样回收试验，结果表明方法回收率好，准确度高，结果见表2。

表2 3种乌头类生物碱加样回收实验结果Tab.2 Results of recovery tests for the three kinds of aconitine alkaloids

2.11 样品测定精密量取本品50 mL，按2.3项下制备供试品溶液，按2.1项和2.2项下的色谱条件和质谱条件测定供试品溶液，以外标法定量，结果见表3。

表3 样品的测定结果(n=3)Tab.3 Contents of the three kinds of aconitine alkaloids in the samples(n=3)

3 讨论

3.1 测定方法的选择曾经摸索用普通的液相色谱来测定，由于正骨水是经过蒸馏提取而制成的，并且不同产地和炮制方法的草乌药材，其生物碱的含有量不一样，在厂家提供的样品中含3种乌头碱的含有量都比较低，达不到液相的检出浓度，由于LC-MS/MS具有灵敏度高，选择性好，能够很好的测定正骨水中的3种乌头碱的含有量。

3.2 样品的提取方法的选择由于正骨水是由26味药材提取而得，成分非常多，而且基质复杂，也曾经尝试用直接进样来测定乌头类生物碱，结果基质效应太严重，无法测定;并且正骨水中含有水，用普通的水浴很难蒸干，改用水浴减压蒸干，最后也还有大概15 mL黏稠的液体，用氨水使成碱性环境，使成单体成分存在，再用乙醚提取，在提取过程中很容易乳化，改用离心能够达到很好的分层。

3.3 检出限的测定由于用LC-MS/MS测定，仪器灵敏度都非常高，最后测定出3种乌头碱的检出限均为0.01 ng/mL。

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