RP-HPLC 同时测定蒙药查干-扫日老-4汤中槲皮素和甘草苷

许良，李英豪，包呼和牧区乐，刘景林

(内蒙古民族大学化学化工学院，内蒙古通辽028042)

多年的蒙医临床实践证明蒙药查干-扫日老-4汤是具有清热，止咳，祛痰、缓解胸背刺痛等功效的有效方剂。查干-扫日老-4汤由甘草、北沙参、拳参、紫草茸等四味中药组成［1］的散剂。近年来文献报道，该药具有防治小儿呼吸道感染作用［2］。该蒙药的薄层鉴别法［3］已有报道。槲皮素为处方中拳参的主要药效成分之一，具有抗炎、抗过敏、抗胃溃疡、利尿、抗感染、抗肿瘤、抗病毒作用，具有较好的祛痰、止咳、平喘作用［4］。甘草苷为处方中甘草的代表性黄酮类活性成分之一。因此，本实验拟建立同时测定蒙药查干-扫日老-4汤中2种指标成分的反相高效液相色谱法［6-15］，以便为该制剂的质量控制提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器Waters高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Waters 600E泵，2996二级管阵列检测器(DAD)Waters Empower工作站;KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);电子天平(北京赛多利斯仪器系统公司)。

1.2 试药甲醇(色谱纯，天津市光复精细化工研究所);蒸馏水(自制);乙腈(国药集团化学试剂沈阳有限公司);无水乙醇(天津市天力化学试剂有限公司);槲皮素对照品、甘草苷对照品(均购自中国药品生物制品检定所);查干-扫日老-4汤(内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室，批号:20100130、20100512、20100620、20100704)。

2 溶液的制备

2.1 对照品溶液的制备

精密称取槲皮素标准样品2.8 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得含槲皮素质量浓度为0.28 mg/mL的对照品溶液。

精密称取甘草苷标准样品2.5 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得含甘草苷质量浓度为0.25 mg/mL的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备精密称取蒙药查干-扫日老-4汤1.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇20 mL，经超声处理35 min，冷却，过滤，在25 mL量瓶中定容。得浓度为0.04 g/mL的查干-扫日老-4汤溶液，进样时经0.22 μm微孔滤膜做过滤处理。

3 色谱条件

色谱柱为symmetry C18(250 mm×5.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(35∶65);体积流量为0.8 mL/min，柱温25℃;检测波长273 nm;进样量10 μL。

4 系统适用性试验

理论塔板数按槲皮素计算不低于4 600，按甘草苷计算不低于4 700，槲皮素与其他组分实现完全分离，甘草苷的分离度大于1.6，在以上色谱条件下，槲皮素对照品，甘草苷对照品，查干-扫日老-4汤供试品和阴性样品的色谱图见图1。

图1 甘草苷和槲皮素RP-HPLC色谱图Fig.1 RP-HPLC chromatograms of liquiritin and quercetin

5 线性关系考察

在上述色谱条件下，精密量取槲皮素对照品溶液2.0、6.0、10.0、16.0、20.0 μL进样，记录色谱图。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，进行线性回归。得回归方程Y=881 367X+295 343，R=0.999 9。表明槲皮素在0.56～5.6 μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。精密量取甘草苷对照品溶液2.0、6.0、10.0、16.0、20.0 μL进样，记录色谱图。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，进行线性回归。得回归方程Y=278 966X+78554 ，R=0.999 8，表明甘草苷在0.50～5.0 μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

6 重复性与稳定性试验

6.1 重复性试验取同一供试品溶液(批号:20100130)查干-扫日老-4汤，按2.2项供试品溶液的制备方法制备5份供试品溶液，分别测定，结果槲皮素和甘草苷的RSD分别为1.57%和1.89%，表明重复性较好。

6.2 稳定性试验取同一供试品溶液查干-扫日老-4汤(批号:20100130)，按上述色谱条件，分别在l、2、4、6、8、12 h进样测定供试品溶液中槲皮素和甘草苷的RSD为1.68%和1.77%，表明槲皮素和甘草苷至少在12 h内稳定。

7 精密度试验

精密吸取槲皮素(0.25 mg/mL)和甘草苷(0.28 mg/mL)对照品溶液，分别重复进样5次，每次进样5 μL，结果槲皮素峰面积RSD为1.35%，甘草苷峰面积RSD为1.45%的表明该方法精密度良好。

8 加样回收率试验

精密量取已知含有量的查干-扫日老-4汤样品(批号:20100130)0.500 0 g共6份，置于25 mL量瓶中，分别加入一定质量浓度的槲皮素和甘草苷对照品溶液1 mL，照2.2项供试品溶液的制备方法制备样品，根据标准曲线线性范围，按一定比例稀释，在上述色谱条件下测定，计算回收率，结果见表1。

表1 槲皮素和甘草苷加样回收率试验结果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests of quercetin and liguiritin(n=6)

9 样品测定

分别精密称取3份样品各1.000 0 g。按2.2项供试品溶液的制备方法制备溶液，稀释，精密吸取供试品溶液10 μL，在上述色谱条件下进样测定。计算槲皮素和甘草苷的质量分数，结果见表2。

表2 样品测定结果(n=6)Tab.2 Results of sample determination(n=6)

10 讨论

10.1 供试品制备过程中，考察了回流提取法和超声提取法对样品中槲皮素和甘草苷提取率以及色谱分离度的影响。结果表明，超声提取法的提取率高于回流提取法，同时前者有利于改善被测组分色谱分离度。此外，超声提取法有着提取效率高、时间短、节约能源等有点。因此，本实验采用超声提取法制备样品。

10.2 等度洗脱就可以达到样品被测组分的分离目的。温度变化对被测组分的保留时间无影响，实验在室温条件下进行。流动相比例为乙腈-水(35∶65)时被测两组分的保留时间适宜，被测组分色谱峰对称，无需在流动相中加入色谱峰改型剂，色谱分离度满足要求。

［1］内蒙古自治区卫生厅，内蒙古蒙成药标准［S］.赤峰:内蒙古科学技术出版社，1984.

［2］韩春平，王青虎，敖日布.蒙成药查干-扫日劳-4汤的薄层色谱鉴别研究［J］.时珍国医国药，1999，10(11):835-836.

［3］红梅，德钦.蒙药查干扫日老-4汤治疗小儿支气管炎［J］.中国民族医药杂志，2009，8(8):76.

［4］欧明，林励，李衍文.简明中药成分手册［M］.北京:中国医药科技出版社，2003:379.

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［6］江波，孙立立，杨书斌，等.HPLC测定侧柏炭中槲皮苷与槲皮素的含量［J］.中成药，2005，27(7):792-794.

［7］靳凤云，贺祝英，赵杨，等.HPLC测定华盖散传统汤剂与颗粒汤剂中盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、甘草酸、甘草苷的含量［J］.中成药，2008，30(1):80-86.

［8］王春丽，张学兰.HPLC测定莲房不同炮制品中金丝桃苷和槲皮素的含量［J］.中成药，2010，32(10):1729-1733.

［9］段天璇，于密密，刘春生，等.HPLC法同时测定甘草指纹图谱暨甘草苷、甘草酸含量［J］.中成药，2006，28(2):161-165.

［10］贾晓斌，朱静，黄洋，等.HPLC法同时测定透骨灵橡胶膏中槲皮素、原儿茶酸和乌头碱［J］.中成药，2011，33(11):1927-1930.

［11］张翔，韩继永，HPLC法同时测定养血化瘀合剂中阿魏酸、甘草苷和甘草酸［J］.中成药，2011，33(4):622-625.

［12］文谨，刘起华，王菲.HPLC同时测定参柏颗粒中甘草苷、柚皮苷、盐酸小檗碱［J］.中草药，2011，42(10):2005-2007.

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