柱前衍生化HPLC法测定丹红注射液氨基酸

裴玉，肖雪，付婵，应旭辉，梁琼麟，王义明，罗国安1，*

(1.江西中医学院研究生部，江西南昌330004;2.南开大学药学院，天津300071;3.清华大学分析中心，北京100084)

丹红注射液是由传统的活血化瘀中药丹参、红花提取的复方制剂。临床上丹红注射液用于冠心病、心绞痛、心肌梗死、瘀血型肺源性心脏病(肺心病)、脑血管疾病、萎缩性胃炎以及高血压肾病等［1］。氨基酸类化合物作为一类常见的大类成分，在以往的中药注射液研究中常被忽视，本试验为更准确地控制丹红注射液质量，对其所含氨基酸进行测定。本试验采用了OPA-FMOC联用柱前衍生HPLC法［2-4］，进行了氨基酸定量测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器Agilent 1200液相色谱仪，包括在线真空脱气机，二元梯度泵，DAD检测器，柱温箱，自动进样器(美国Agilent公司);Agilent ChemStation工作站;XP205型十万分之一电子天平(瑞士Mettler Toledo公司);Millipore Elix 5超纯水仪(美国Millipore公司)。

1.1.2 试药醋酸钠、氢氧化钠、硼酸、36%醋酸、四氢呋喃、三乙胺(分析纯，国药集团化学试剂有限公司);水为超纯水;乙腈、甲醇(色谱纯，J.T Baker公司);FOMC、OPA、巯基丙酸及各氨基酸标准品:天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)、、丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)、蛋氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)，纯度≥99.0%，均购自Sigma公司。

1.1.3 样品丹红注射液(菏泽步长制药有限公司提供，批号为100412、100413、100414、100415、100416、100417、100418、100419)。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制

OPA衍生试剂配制精密称取OPA 40 mg，加入0.4 mol/L硼酸盐缓冲液(pH 10.4)3.5 mL，乙腈0.5 mL，巯基丙酸63 μL，混匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

FOMC衍生试剂的配制精密称取9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)25 mg，加入5 mL乙腈溶解，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

氨基酸混合标准品溶液的配制精密称取各氨基酸标准品适量，以1%HCl溶液定容至100 mL。单个氨基酸在混合标准液中的质量浓度如下:天冬氨酸0.107 8 mg/mL，谷氨酸0.895 2 mg/mL，天冬酰胺0.064 0 mg/mL，丝氨酸0.053 6 mg/mL，甘氨酸0.162 8 mg/mL，苏氨酸0.068 7 mg/mL，胱氨酸0.104 1 mg/mL，丙氨酸0.142 6 mg/mL，精氨酸0.147 9 mg/mL，酪氨酸0.041 7 mg/mL，甲硫氨酸0.040 9 mg/mL，缬氨酸0.533 0 mg/mL，色氨酸0.051 0 mg/mL，苯丙氨酸0.206 0 mg/mL，异亮氨酸0.452 0 mg/mL，亮氨酸0.282 0 mg/mL，脯氨酸0.456 0 mg/mL;临用前使用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

总氨基酸供试液的配制分别取各注射液1 mL于具塞试管中，加入6 mol/L盐酸9 mL，氮封后盖紧瓶盖，110℃恒温水解24 h;水解液70℃水浴蒸干，后加入1%盐酸2 mL，超声10 min，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

1.2.2 色谱条件本实验室经过摸索建立了一个切实可行的测定氨基酸的方法，已在《邻苯二甲醛-9-氯甲酸芴甲酯柱前衍生HPLC法测定血必净注射液中氨基酸》［5］有所应用。具体方法如下:Agilent SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相A为0.02 mol/L醋酸钠溶液(含200 μL/L三乙胺和3.5 mL/L四氢呋喃，2%醋酸溶液调pH 7.2±0.05)，流动相B为0.02 mol/L醋酸钠溶液-甲醇-乙腈(200∶400∶400)(pH 7.2±0.05);柱温40℃;检测波长、洗脱梯度及体积流量见表1。进样量:20 μL。

表1 流动相梯度顺序Tab.1 Gradient elution program

2 结果与讨论

2.1 实验条件考察采用1.2.2项下色谱条件得到混合标准品溶液色谱图及丹红注射液水解氨基酸色谱图，见图1。

图1 混合标准品(A)和丹红注射液样品(B)HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference solution(A)and Danhong Injection(B)

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验取氨基酸混合标准品溶液，按2.2项下色谱条件，连续进样6次，记录各氨基酸色谱峰的保留时间和峰面积，并计算RSD，各氨基酸的RSD均小于0.41%，结果表明精密度良好，结果见表2。

表2 精密度、稳定性试验结果(n=6)Tab.2 Results of precision test and stability test(n=6)

2.2.2 稳定性试验取氨基酸混和标准品溶液，按2.2项下色谱条件进样分析，分别于0、2、4、8、12、24 h时进样，记录各氨基酸色谱峰的保留时间和峰面积，并计算其RSD，各氨基酸的RSD均小于2.63%，结果表明样品24 h内稳定性较好，结果见表2。

2.2.3 线性范围本试验考察了从母液到稀释30倍样品的一系列质量浓度梯度，结果见表3。从结果可见，各氨基酸在其质量浓度范围内，线性关系良好。

表3 各氨基酸线性质量浓度范围Tab.3 Linear equations and linear ranges

2.2.4重复性试验取某一批丹红注射液水解液，滤过，平行操作，配制4个样品，进样。结果各氨基酸的RSD小于4%，重复性良好。见表4。

表4 重复性试验结果Tab.4 Results of reproducibility test

2.2.5 加样回收率实验取同一批丹红注射液，稀释10倍，水解后滤过，按样品制备方法平行制备9份样品，按照80%，100%，120%的比例加入数个标准品(谷氨酸、脯氨酸等)，按2.2项下条件测定，计算加样回收率，结果见表5。

根据结果可知，各氨基酸加样回收率均在95%～105%之间，说明该方法准确度和精确度高，方法可靠。

2.3 结果丹红注射液氨基酸定量测定采用了HPLC柱前衍生化法，先用衍生试剂与氨基酸进行衍生化反应，然后再用紫外检测器对其进行检测，其色谱图见图1。测定了7批丹红注射液，结果见表6，7批丹红注射液水解氨基酸测定平均值为1.680 mg/mL。可以看到:丹红注射液经过水解后，质量浓度最大的为谷氨酸，其次为脯氨酸、亮氨酸、缬氨酸等;质量浓度较小的组氨酸、精氨酸及蛋氨酸，其质量浓度均小于0.002 mg/mL。本实验检测到谷氨酸、脯氨酸等氨基酸的质量浓度RSD较大，提示丹红注射液质量稳定性有待提高。本试验所建立的HPLC分析方法对氨基酸的检测选择性好、分离度高、重复性强，可用于丹红注射液中氨基酸的检测及质量控制。

表5 主要氨基酸回收率试验结果Tab.5 Results of recovery test

表6 样品测定结果Tab.6 Results of Danhong Injection samples

3 讨论

按照国家中药注射液安全再评价标准:“多成分制成的注射剂，所测成分应大于总固体量的80%;而经质量研究明确结构的成分，应当在指纹图谱中得到体现，一般不低于已明确成分的90%”。丹红注射液中含有多种氨基酸，其量约占总固体的5.9%(测定丹红注射液总固体量均值为28.33 mg/mL)，因此测定其中氨基酸的含有量势在必行。当前中药注射液的不良反应中以过敏反应［6-10］最为明显，引起过敏的异体蛋白可能和其中所含结合氨基酸［11-12］有关。本实验中氨基酸类成分研究可为更好地探究中药注射液的物质基础提供依据，以期达到临床安全用药的目的。

致谢本试验所需样本均有菏泽步长制药有限公司提供，对参与该项工作的该公司质检部王臣臣、管雪梅、郭晓光及生产车间等人员一并感谢。

［1］郄素会，刘增娟，郝哲.丹红注射液的临床研究概况［J］.现代中西医结合杂志，2009，18(28):3520-3522.

［2］Herbert P，Cabrita M J，Ratola N，et al.Relationship between biogenic amines and free amino acid contents of wines and musts from Alentejo(Portugal)［J］.J Environ Sci Health B，2006，41(7):1171-1186.

［3］尤进茂，樊兴君，欧庆瑜，等.氨基酸柱前衍生化的3种新荧光试剂的光谱特性及高效液相色谱研究［J］.分析化学，1998，26(10):1196-1200.

［4］Furst P，Pollack L，Graser T A，et al.Appraisal of four precolumn derivatization methods for the high-performance liquid chromatographic determination of free amino acids in biological materials［J］.J Chromatogr A，1990，499:557-569.

［5］黄浩，肖雪，傅俊曾，等.OPA-FMOC联用柱前衍生HPLC法测定血必净注射液中氨基酸［J］.现代药物与临床，2011，26(1):58-62.

［6］孙彩华，姜丽丽.丹红注射液的不良反应及防治措施［J］.海峡药学，2006，18(6):181-182.

［7］俞建芬.静滴丹红注射液的不良反应报告与分析［J］.临床和实验医学杂志，2009，8(3):141.

［8］朱宇欢，陶建青.浅析中药注射液不良反应发生原因和应对措施［J］.中国实用医药，2009，4(11):220-221.

［9］唐进法，李学林.丹红注射液不良反应的文献研究［J］.中国药房，2011，22(3):261-262.

［10］柳青，雷招宝.丹红注射液的不良反应及合理应用［J］.中成药，2010，32(11):1964-1966

［11］王世伟，张小慧.中药注射剂的不良反应现状及注意事项［J］.不良反应监测，2011，8(4):118-119.

［12］周冠月.清开灵注射液中多肽含量的快速测定及杂质蛋白的限量检查［D］.北京:北京中医药大学，2011.