HPLC 法同时测定知柏八味口服液中芒果苷、盐酸小檗碱和丹皮酚

何梅凤，吴伟，唐细兰，陈雷宇，陈茂玲(中山大学中山眼科中心，广东广州510060)

知柏八味口服液是根据中医眼科中的慢性炎症特征，在知柏地黄丸［1］处方基础上进行药味加减及剂型改变而成，含知母、黄柏、牡丹皮、生地等八味中药，具有滋阴降火，补肾明目的功效，用于治疗肾阴不足，水亏火旺的眼病;视网膜静脉周围炎，视网膜脉络膜病变，慢性葡萄膜炎，慢性结膜炎及干眼症等，效果满意［2］。方中君药知母与黄柏，为苦寒清热之品，是常用配伍药对，芒果苷是知母清热作用的主要有效成分，盐酸小檗碱既是黄柏的指标成分又是活性成分［3］，两者起到相辅相成的作用［4］;丹皮酚是牡丹皮的主要有效成分，具有抗菌、抗炎等药理作用［5-6］。本实验通过建立高效液相色谱法同时测定上述3种成分的含有量，较好地解决原质量指标体系不完善等缺陷，有效控制该制剂的质量。

1 仪器与材料

Agilent 1100高效液相色谱系统，包括G1314A紫外检测器，G1316A柱温箱，G1329A带温控自动进样器，G1311A四元泵，G1322A真空脱气机(美国安捷伦公司);Agilent 1100化学工作站;BT125D电子天平(北京赛多利斯有限公司)。知柏八味口服液(本中心制剂，粤药制字Z20071453);芒果苷(批号:111607-200402)、盐酸小檗碱(批号:110713-200911)、丹皮酚(批号:110708-200506)对照品(中国药品生物制品检定所);水为超纯水;乙腈为色谱纯;其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱为Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，迪马公司);流动相为乙腈(A)-33 mmol/L磷酸二氢钾(B)，采用梯度洗脱，O～9 min，5%A，9～22 min，11%A，22～27 min，11%～28%A，27～32 min，28%A，32～35 min，28%～31%A，35～40 min，31%A，40～50 min，31%～42%A;柱温50℃;体积流量0.9 mL/min;检测波长317 nm;进样量40 μL。在上述色谱条件下，供试品中芒果苷、盐酸小檗碱和丹皮酚色谱峰与相应对照品色谱峰保留时间一致，其他组分对测定无干扰，色谱图见图1。

图1 混合对照品(A)、样品(B)和阴性样品(C)的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)，sample(B)and negative sample(C)

2.2 混合对照品溶液的制备分别取芒果苷、盐酸小檗碱和丹皮酚对照品适量，精密称定，加流动相溶解并定容，制成质量浓度分别为25.76、53.31、29.31 μg/mL的混合溶液，作为混合对照品贮备液。分别精密量取一定体积的混合对照品贮备液于量瓶中，加流动相稀释成系列质量浓度的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备精密量取供试品1 mL，置50 mL量瓶中，加水至定容，用0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.4 阴性样品溶液的制备按知柏八味口服液处方比例，称取除知母、黄柏和牡丹皮的各味药材，制得样品，再按供试品溶液制备方法，制得阴性样品溶液。

2.5 线性关系考察分别精密吸取混合对照品贮备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置10 mL量瓶中，加流动相定容，得各系列质量浓度对照品溶液，按2.1项色谱条件分别进样，测定组分峰面积，以峰面积A为纵坐标、以质量浓度C为横坐标绘制标准曲线，得芒果苷回归方程为A=93.033 2 C+3.191 4(r=0.999 9);盐酸小檗碱回归方程A=64.671 0 C+3.592 0(r=0.999 9);丹皮酚回归方程A=92.262 3 C+4.291 1(r=0.999 8);表明芒果苷、盐酸小檗碱和丹皮酚分别在1.288～12.88 μg/mL，2.666～26.655 μg/mL和1.466～14.655 μg/mL质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验取混合对照品溶液连续重复进样6次，分别测定峰面积，计算得芒果苷、盐酸小檗碱和丹皮酚峰面积的RSD分别为0.9%、0.8%、1.1%。表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验精密量取同一批知柏八味口服液(批号120205)共6份，按2.3项下方法制备，按2.1项色谱条件分别进样测定，计算得芒果苷、盐酸小檗碱和丹皮酚含有量的RSD分别为1.8%、1.1%和1.3%。表明本法重复性良好。

2.8 稳定性试验取同一供试品溶液(批号120205)每隔2 h进样测定1次，共进样6次，测定峰面积，计算得芒果苷、盐酸小檗碱和丹皮酚峰面积的RSD分别为2.1%、1.7%和1.4%。结果表明供试品溶液在10 h内基本稳定。

2.9 加样回收率试验精密量取知柏八味口服液(批号120205)0.5 mL，共9份(3份1组)，分别置于50 mL量瓶中，各组分别加入混合对照品贮备液3.0、4.0、5.0 mL，加水至定容，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液40 μL，按2.1项下色谱条件进样测定并计算加样回收率，结果见表1。2.10样品测定分别取3批样品，每批平行3份，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件分别进样，测定峰面积，根据标准曲线回归方程计算供试品中芒果苷、盐酸小檗碱和丹皮酚的质量浓度，结果见表2。

表1 加样回收率试验结果(n=9)Tab.1 Results of recovery tests of samples(n=9)

表2 样品测定结果(n=3)Tab.2 Determination results of samples(n=3)

3 讨论

3.1 知柏八味口服液作为复方制剂，所含化学成分复杂且极性相差较大，采用乙腈-水或乙腈-磷酸盐缓冲液作为流动相等度洗脱，难以将待测组分与样品中其他组分达到基线分离。本实验采用梯度洗脱，以及通过优化体积流量和调节柱温为50℃，可将3个目标峰有效分离，且无其他峰干扰，效果较满意。

3.2 芒果苷、盐酸小檗碱和丹皮酚的测定波长多分别采用317、265 nm和274 nm［7-12］，由于知柏八味口服液中小檗碱和丹皮酚的色谱响应值较大，为了缩小3种成分吸收强度的差别，且不影响测定的准确性，经试验，最终确定检测波长为317 nm，3者的吸收峰均较好。

3.3 尚未见同时测定芒果苷、盐酸小檗碱和丹皮酚的报道，本试验采用HPLC同时测定知柏八味口服液中上述3种有效成分的含有量，方法简便、准确，可用于该制剂的质量控制。

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