大孔吸附树脂纯化贯叶连翘提取物的工艺

雷雪，刘富岗，杨云

(河南中医学院药学院，河南郑州450008)

贯叶连翘Hypericum perforatum L.为藤黄科金丝桃属的干燥地上部分［1］，其有效成分金丝桃素，具有明显的抗抑郁、抗病毒、抗肿瘤，以及显著的抗DNA、RNA病毒作用，并可用于治疗艾滋病［2-5］。大孔吸附树脂为一种有机高聚吸附剂，具有选择性好、吸附容量大、解析容易、再生简便等优点［6］。目前市场上的贯叶连翘提取物普遍存在金丝桃素量较低的现象，严重阻碍了贯叶连翘药材及其制剂的进一步开发利用［7］。为了得到金丝桃素量较高的贯叶连翘提取物，且国内外对贯叶连翘提取物的金丝桃素量应不低于0.3%为指标［8］，本实验采用大孔吸附树脂的方法纯化贯叶连翘提取物，以金丝桃素为指标，对贯叶连翘提取物纯化工艺进行静态和动态吸附-解吸研究，最终选取LSA－10型大孔吸附树脂，并确定其最佳纯化工艺。

1 仪器与试药

BS210S型电子天平(北京赛多利斯公司);LC—20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司);METTLER AE240电子分析天平(瑞士梅特勒-托利公司)等。

贯叶连翘药材购于陕西渭南，经河南中医学院药学院董诚明教授鉴定为藤黄科金丝桃属植物贯叶连翘的干燥地上部分;金丝桃素对照品(中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，批号:1158-080715);AB－8、S－8大孔吸附树脂(南开大学化工厂);CAD－45、860021大孔吸附树脂(山东鲁抗股份有限公司);D101、DA－201大孔吸附树脂(天津农药总厂);DB－301、HPD－600大孔吸附树脂(沧州宝恩化工有限公司);LSA－10、LSA－20、XDA－6大孔吸附树脂(西安蓝深交换吸附材料有限责任公司);SP－825大孔吸附树脂(日本三菱化学公司);色谱甲醇(天津四友精细化学品有限公司);双蒸水;其余所用试剂的均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 定量测定

2.1.1 色谱条件依利特Hypersil ODS2(5.0 mm×200mm，5 μm)［9］;检测波长590 nm;柱温30℃;检测器为SPD—20A UV/VIS;流动相为甲醇-0.1 mol/L NaH2PO4(97∶3);体积流量1 mL/min。

2.1.2 标准曲线的绘制分别精密吸取对照品溶液1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL进样，按2.1.1项的色谱条件测定，以金丝桃素质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。回归方程为:A=298 457C－469.54，r=0.999 9(n=6)，金丝桃素质量浓度在0.010 4～0.208 μg/mL内线性关系良好。

2.2 大孔吸附树脂类型的选择

2.2.1 上柱溶液的制备称取贯叶连翘药材粉末150 g，精密称定，加10倍量95%乙醇回流提取2次，每次3 h，乙醇提取液于50℃减压浓缩至150 mL，即得。

2.2.2 大孔吸附树脂的预处理根据文献报道的方法对大孔吸附树脂进行预处理［10］。

2.2.3 静态筛选最佳大孔吸附树脂分别称取处理好的大孔吸附树脂S－8、AB－8、CAD－45、860021、DB－301、D101、DA－201、HPD－600、LSA－10、LSA－20、XDA－6、SP－825各5 g，置100 mL锥形瓶中，备用。

在处理好的12种大孔吸附树脂中，精密加入上柱溶液10 mL，振摇，静置吸附24 h，精密吸取未吸附溶液，并蒸干，加甲醇溶解，HPLC法测定金丝桃素，并计算各型号树脂静态饱和吸附量，静态饱和吸附量=(样品中金丝桃素量－吸附后滤液中金丝桃素量)/树脂量(mg/g干树脂)［11］。

滤出已吸附上柱溶液大孔吸附树脂，置于100 mL具筛三角瓶中，依次以30、20、10 mL的95%乙醇超声洗涤，合并洗涤液，于85℃水浴蒸干，用甲醇溶解残渣并转移至10 mL量瓶中并定容，用HPLC法测定金丝桃素，计算12种树脂的静态洗脱率，静态洗脱率=(洗脱液浓度×洗脱液体积)/饱和吸附量×100%，结果见表1。

由表1可知，LSA－20、LSA－10、SP825、S－8、XDA－6 5种大孔吸附树脂较其他类型的大孔吸附树脂的静态吸附量与洗脱率均较高，其静态饱和吸附量为XDA－6＞LSA－10＞S－8＞LSA－20＞SP－825＞1.35 mg/g，静态洗脱率为LSA－20＞LSA－10＞SP－825＞S－8＞XDA－6＞90%，所以选择此5种大孔吸附树脂对其进行动态情况下上柱溶液的吸附与解吸附能力考察。

表1 大孔吸附树脂静态筛选实验结果Tab.1 Static selection results of macroporous resins

2.2.4 动态筛选最佳大孔吸附树脂分别称取处理好的LSA－10、LSA－20、S－8、SP825、XDA－6 5种不同型号的大孔吸附树脂各10 g，分别取上柱溶液40 mL上样，控制体积流量为1 mL/min，预吸附2 h，过柱液重吸附一次，静置12 h。收集过柱液，然后用蒸馏水洗至无色，再用80%乙醇洗至无色，分别收集各段洗脱液，测定金丝桃素浓度，并计算各部分金丝桃素的量。按下式分别计算比上柱量、比吸附量、比洗脱量。比上柱量=(上柱样品液中金丝桃素的量-过柱液中残余金丝桃素的量)/树脂质量;比吸附量=(上柱样品液中金丝桃素的量-过柱液中残余金丝桃素的量-水洗脱液中金丝桃素的量)/树脂质量;比洗脱量=80%乙醇洗脱部分金丝桃素的量/树脂质量，结果如图1。

图1 5种大孔吸附树脂动态吸附性能实验Fig.1 Dynamic absorption experiments of 5 kinds of macroporous resins

从图1可以看出，LSA－10在动态筛选大孔吸附树脂实验的各指标均为最优，结合静态试验，LSA－10大孔吸附树脂静态洗脱率98.9%，静态饱和吸附量1.924 0 mg/g，动态比柱量为1.954 2、比吸附量1.927 0、比洗脱量1.768 2，亦优于其它类型树脂，因此选用LSA－10大孔吸附树脂纯化贯叶连翘提取物。

2.3 LSA－10型大孔吸附树脂的工艺参数考察

2.3.1 不同质量分数乙醇动态洗脱效果的考察称取处理好的LSA－10型大孔吸附树脂10 g，精密称定。取上柱溶液40 mL，控制体积流量1 mL/min上柱，预吸附2 h，过柱液重吸附一次，静置12 h。收集过柱液，分别以5 BV的蒸馏水、20%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇洗脱，每瓶收集1 BV的洗脱液，共收集30份，其中1～5为蒸馏水洗脱液，6～10为20%乙醇洗脱液，11～16为50%乙醇洗脱液，17～22为70%乙醇洗脱液，23～30为95%乙醇洗脱液。将收集到的各洗脱液85℃水浴蒸干，测定金丝桃素。以金丝桃素量(Y)为纵坐标，收集量瓶的编号(X)为横坐标，绘制洗脱曲线，结果见图2。

图2 LSA－10型大孔树脂吸附金丝桃素梯度洗脱曲线Fig.2 Gradient elution curve of adsorption hypericin by LSA－10

图2结果表明，50%、70%、95%乙醇洗脱液为金丝桃素的主要存在部位，占金丝桃素总量的97.67%。而其中50%和70%乙醇洗脱液中金丝桃素量占总量的85.04%，95%乙醇洗脱液中金丝桃素量较少。70%乙醇的极性小于50%乙醇，相对而言可洗脱下的水溶性杂质较少，可基本涵盖50%乙醇洗脱液可以洗脱的金丝桃素量，且综合考虑减少操作工序，节约生产成本等因素，初步确定洗脱条件为先用蒸馏水、20%乙醇洗去水溶性杂质，再以70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱部分。2.3.2洗脱剂用量的考察精密吸取上柱溶液35 mL上柱，依次用蒸馏水、20%乙醇、70%乙醇洗脱，每瓶收集1 BV的洗脱液，依次按1，2，3，…编号，分别浓缩至干，测定每份洗脱液中金丝桃素量。以金丝桃素量(Y)为纵坐标，收集量瓶编号(X)为横坐标绘制洗脱曲线，如图3。

图3 70%洗脱剂用量对金丝桃素洗脱终点的判断Fig.3 Judgment of elution endpoint of by 70%eluant volume

从图3可知，当蒸馏水用量至4 BV、20%乙醇洗脱3 BV时，洗脱曲线已近横轴且所收集的洗脱液几乎无色，说明水溶性杂质已除去。采用70%乙醇洗脱，洗脱至8 BV时曲线已接近横轴，且前8 BV洗脱液中金丝桃素量约占70%乙醇总洗脱量的96%以上，故确定洗脱液溶媒为8 BV 70%乙醇。

2.3.3 影响LSA－10型大孔树脂吸附性能因素的正交试验考察根据文献［12］，大孔吸附树脂的吸附性能与药液浓缩比、柱径高比、上样体积流量等因素有关。本实验采用L9(34)正交试验筛选最佳上柱工艺条件。正交设计的因素水平表见表2。

表2 L9(34)正交设计因素水平Tab.2 L9(34)orthogonal design factors and levels

本正交试验以70%乙醇洗脱液中金丝桃素量(以100 g贯叶连翘药材计)为考察指标，结果见表3，方差分析见表4。

从表3、表4可知，影响因素大小的顺序为B＞A＞C，且方差分析结果表明，A和B因素对实验结果有显著意义(P＜0.05)，最终确定最佳搭配为A2B1C2，即最佳方案为:药液浓缩比为1∶1;层析柱半径与柱高比为1∶20;药液上样体积流量为2 BV/h。

2.4 验证试验以最佳工艺条件进行放大实验，经LSA－10型大孔吸附树脂纯化后，6批样品中金丝桃素量均高于1.5%以上，且转移率达70%以上。远远高于贯叶连翘提取物＞0.3%的国际标准，证明此工艺合理可行。

表3 正交试验设计及结果Tab.3 Design and results of orthogonal tests

表4 方差分析(显著性检验)Tab.4 Variance analysis chart(significance test)

3 讨论

本实验综合考虑静态吸附解吸与动态吸附两方面对大孔吸附树脂纯化贯叶连翘提取物的影响，在静态筛选大孔吸附树脂实验中，HPD－600大孔吸附树脂的静态饱和吸附量较高为1.353 8 mg/g，静态解析率却较低，说明HPD－600对金丝桃素的保留能力过强，较难洗脱;而D101、CAD－45的静态解析率较高，静态饱和吸附量却较低，说明此两类树脂极性较大，保留金丝桃素的能力较弱，均不适于纯化贯叶连翘提取物。而SLA－10大孔吸附树脂既对金丝桃素具有较大吸附量，又且易吸附、易解吸，其静态饱和吸附量为1.924 0 mg/g，静态洗脱率为98.9%，动态比柱量为1.954 2、比吸附量为1.927 0、比洗脱量为1.768 2，可较高效的纯化金丝桃素。在LSA－10型大孔吸附树脂纯化前，贯叶连翘提取物中金丝桃素量为0.38%，经其纯化后，金丝桃素量高于1.5%，表明LSA－10适合于贯叶连翘金丝桃素的纯化，且其最佳工艺条件为LSA－10型大孔吸附树脂纯化贯叶连翘提取物，以层析柱半径与柱高比为1∶20;药液浓缩比为1∶1，药液上样体积流量为2 BV/h，4 BV蒸馏水、3 BV 20%乙醇为除杂洗脱溶剂，收集8 BV的70%乙醇洗脱液，减压回收，真空干燥，即得纯化的贯叶连翘提取物。

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