青蒿素半乳糖苷对人宫颈癌HeLa细胞株的增殖抑制作用

任彦荣

(重庆第二师范学院生物与化学工程系，重庆400067)

青蒿素是一种具有高效抗疟作用的活性成分，在临床上得到广泛的应用。但由于其油溶性和水溶性均较差，很难制成合适的剂型，加之复燃率高等缺点，限制了其临床应用。因此通过对青蒿素进行结构修饰以期得到性能理想的衍生物成为研究的热点。从上世纪七十年代开始到现在，已经合成了成千上万种青蒿素衍生物。合成的思路主要基于以下两个方面:(1)保留过氧桥活性中心，主要对12位碳原子进行修饰，将亲脂性、亲水性基团引入结构中改善溶解性，基团主要有醚类、酯类和杂原子取代等。(2)合成双活性基团衍生物。通过双青蒿素分子间脱水，以及用二元酸、二元醇为连接链段的青蒿素酯类或醚类二聚体;或者将具有生理活性的大分子如甾体等引入青蒿素结构中，以增强稳定性。虽然目前已合成出众多衍生物，但仍然没找到比目前上市的蒿甲醚、蒿乙醚、双氢青蒿素和青蒿琥酯效果更好的化合物。而且动物实验发现大剂量长期使用上述药物，可引发中枢神经系统损害及心电图的变化，这些药物仍具有复燃率高、半衰期短及口服生物利用度低等缺点。青蒿琥酯在水中不稳定，必须用前溶解于碳酸氢钠制成钠盐，使用不方便。因此如何更好地解决以上问题，寻找溶解性更好、毒理作用更小的衍生物，具有重要的意义。由于糖是生物体内重要的活性物质，具有良好的溶解性能和多种生理药理功能，近年来在药物修饰中得到广泛应用。另有研究显示酶催化合成反应具有诸多优点，如反应条件较温和、对环境较友好，目标产物简单、具有高度区域和立体选择性，且易于分离纯化，合成路线简化。因此，本研究基于糖基转移酶催化糖苷化反应的原理，采用生物酶催化的方法对青蒿素进行糖基化修饰。由于糖基转移酶具有严格的底物专一性［1］，以应用广泛的半乳糖为底物，确定了优化的反应条件，最终合成一种半乳糖基青蒿素衍生物(见图1)，然后对其结构进行鉴定，相关研究证实，青蒿素及其衍生物可明显抑制癌细胞活性［2-6］，基于此，本研究检测了其体外抗癌活性。

图1 合成路线Fig.1 Synthetic route of glycosylated artemisinin

1 材料与仪器

1.1 药物与仪器青蒿素购自中国药品生物制品检定所;半乳糖、半乳糖基转移酶为国药集团化学试剂厂产品;IMDM培养基购自美国Gibco公司;胰酶、蛋白酶K、Hoechst 33342、碘化丙啶(PI)均为Sigma公司产品。由Varian INOVA-400型核磁共振仪测定1HNMR;由Finnigan-MAT 4510型质谱仪测定MS;由美国热电Varon傅立叶红外光谱仪测定IR。

1.2 细胞株人宫颈癌HeLa细胞株由第三军医大学实验中心提供。

2 方法与结果

2.1 合成方法确定和工艺条件优化本研究选择在食品中常见的、应用广泛的葡萄糖、果糖、核糖和半乳糖为底物。因目前商品化的糖基转移酶并不多，本研究选择底物专一性很强的半乳糖糖基转移酶催化半乳糖底物，葡糖基转移酶催化其他3种底物。采用薄层层析法对糖基化反应的可行性进行初步验证。结果显示，以核糖和果糖为底物时没有产生糖基化衍生物，而葡萄糖和核糖会发生微量自聚集现象，影响产物质量。而以半乳糖为底物时，催化反应效率最高，底物较稳定，无自聚现象。因此最终确定以半乳糖为底物。

通过对生物酶催化合成青蒿素半乳糖苷的反应条件进行优化，分析了不同缓冲体系、温度、时间以及搅拌速率对反应的影响。结果显示，缓冲体系的pH值与酶催化反应关系最为密切，pH值在7～8范围其酶活性最好。反应温度、时间、半乳糖用量及搅拌速率等因素均对反应的效率有一定影响。根据青蒿素半乳糖苷糖基化百分率，确定最佳反应条件为:10 mL反应体系中，采用pH为7.4的磷酸缓冲液，半乳糖10 mmol，反应温度32℃，搅拌速率(转速)200 r/min，反应时间6 h。

2.2 青蒿素半乳糖苷的酶催化合成与表征以半乳糖为给体原料，半乳糖糖基转移酶作为催化酶，按文献［7］的方法制备半乳糖尿苷酸(UDP)衍生物的糖基给体。将5 mmol(1.410 7 g)二氢青蒿素溶于50 mmol/L的NaN3中，加入UDP活化的10 mmol半乳糖糖基给体及5 μmol半乳糖糖基转移酶，磷酸缓冲液(pH7.4)稀释至10 mL，32℃、200 r/min孵育6 h。然后在50 mmol/L的NaN3和磷酸缓冲液(pH7.4)中充分透析，以去除未结合的糖分子。本合成反应在NaN3保护体系中进行，可防止反应体系与空气中的O2接触发生氧化。结果显示半乳糖糖基化百分率达68%，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测证实，产物达到电泳纯的纯度。

合成产物的表征数据:1H NMR(CDCl3)δ:5.44(s，1H，CH)，4.96(d，1H，J=6.7 Hz，CH)，4.92(d，1H，J=3.4 Hz，CH)，3.43～3.76(m，6H，CH and CH2，为糖环质子信号)，1.26(s，3H，CH3)，0.91(d，3H，J=6.5 Hz，CH3)，0.82(d，3H，J=6.2 Hz，CH3);13C NMR(CDCl3):8.5，14.5，16.6，18.7，19.5，24.8，27.2，30.1，30.8，30.5，31.7，62.5，68.1，69.0，73.1，72.1，84.3，92.4，92.8，96.1，97.9;LCMS(APCI:CHCl3)m/z(%):445.48(M-1+，100);IR(KBr cm－1)Vmax:3 380，2 946，2 935，1 135，1 027，1 014。

1H NMR中δ5.44、4.92、1.26、0.91、0.82与二氢青蒿素的特征吸收峰相同，δ4.96为连接二氢青蒿素的半乳糖分子端基碳上的H原子，其J值为6.7 Hz，表明半乳糖端基C为β构型。13C NMR谱中共有21个信号(溶剂峰除外)，每分子青蒿素半乳糖苷共有21个碳原子，其中15个位于母体青蒿素分子，6个位于半乳糖分子，由此可确定目标产物为青蒿素半乳糖苷。

2.3 青蒿素半乳糖苷体外抗癌作用

2.3.1 青蒿素半乳糖苷对癌细胞抑制作用以青蒿素作对照，用MTT法测定青蒿素半乳糖苷的对癌细胞活性的抑制作用。根据文献［8］，IMDM培养液将青蒿素半乳糖苷或青蒿素稀释配成40 μmol/L的工作液;单层培养的HeLa细胞经胰蛋白酶消化后配成单细胞悬液，接种于96孔板，密度4×104个/孔，每孔200 μL，37℃、5%CO2、相对湿度100%条件下培养24 h，弃培养液，加入青蒿素半乳糖苷或青蒿素工作液，继续培养8、12、24、48、72 h。结束培养4 h前，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)溶液，孵育，终止培养后弃上清培养液，加入DMSO，振荡，酶标仪检测492 nm和630 nm波长吸光度值A，按下述公式计算癌细胞抑制率，结果以均数±标准差表示，采用SPSS 19.0软件对组间结果进行t检验分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果如图2所示，青蒿素半乳糖苷可显著抑制HeLa细胞的生长，并且抑制效果显著高于青蒿素对照组(P＜0.01)。随着青蒿素半乳糖苷处理细胞的时间延长，抑制率逐渐增大，表明在一定范围内，其对癌细胞抑瘤效果具有明显的时间效应关系。

图2 青蒿素半乳糖苷与青蒿素对HeLa细胞的抑制作用比较Fig.2 Inhibitory action of galactosylated artemisinin and artemisinin on proliferation of He-La cell

2.3.2 青蒿素半乳糖苷对癌细胞凋亡的影响样本细胞数调至1.5×106mL－1，孵育缓冲液(CaCl25 mmol/L，HEPES/NaOH 10 mmol/L，NaCl 140 mmol/L，pH7.4)洗1次，避光室温孵育15 min，孵育缓冲液洗1次，滴加Hoechst33342和PI染液，4℃孵育20 min，荧光显微镜观察，波长488 nm和560 nm激发光分别检测Hoechst33342和PI。

结果如图3，HeLa细胞经药物作用48 h后，青蒿素半乳糖苷处理的癌细胞呈现大量浓染或碎裂染色特征的细胞核，表明大量凋亡细胞出现，而青蒿素处理的HeLa细胞呈均一染色的正常细胞核较多，而呈现上述凋亡现象的细胞较少，表明青蒿素半乳糖苷可显著诱导癌细胞凋亡，其效果明显优于青蒿素。

图3 青蒿素半乳糖苷对癌细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of galactosylated artemisimin on apoptosis of cancer cell

3 讨论

目前关于青蒿素糖基化的酶催化合成没有相关的文献报道，本研究首次利用糖基转移酶来催化青蒿素的糖基化反应，最终产物经过表征，确定其为青蒿素半乳糖苷。与化学合成方法相比，利用酶催化反应可大幅度提高合成效率，而且半乳糖转移酶的底物专一性很强，仅催化半乳糖基给体发生反应。另外，酶催化合成青蒿素糖基化衍生物还具有反应条件温和，操作方便易行，合成过程中无毒性物质产生，目标产物易于分离纯化、纯度高等优势，具有推广意义。虽然利用糖基转移酶合成青蒿素半乳糖苷类化合物具有一些化学方法所无可比拟的优势，但仍然存在一些问题，如原料价格较为昂贵，造成其应用的成本高，难以规模化应用;另外，酶的稳定性和溶解性在后续研究中还有待改进，可通过固化、生物反应器等方法，使其能够规模化生产，这都是未来需解决的问题。

本研究进一步研究了青蒿素半乳糖苷的抗癌活性。目前关于青蒿素及其衍生物抗肿瘤的机制尚未完全阐明［9-10］，文献报道的机制显示关键可能在于细胞周期的调控［11-13］。本研究将糖基化青蒿素与青蒿素比较，初步探讨了两者对癌细胞的作用。根据文献［8］中青蒿素抗肿瘤实验结果，以及前期研究［14］，得出了不同剂量(10、20、40、80、160、320 μmol/L)半乳糖基化青蒿素作用于人宫颈癌HeLa细胞48 h的剂量-效应关系。结果显示，浓度40 μmol/L最为接近引起50%细胞死亡(IC50)的浓度，所以本研究以IC50浓度40 μmol/L作为效应浓度。实验结果显示半乳糖基化修饰后青蒿素衍生物与青蒿素相比抗肿瘤作用显著提高，具有明确的诱导肿瘤细胞凋亡的作用，这可能与糖基化修饰后青蒿素衍生物水溶性、亲和性或者生物利用效率的提高有关，但其具体机制尚需进一步研究。该研究不仅为糖基化修饰的青蒿素衍生物合成提供了新的方向，也为明确青蒿素半乳糖苷的抗癌活性提供了初步依据。

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