垂体催乳素腺瘤细胞体外培养的实验研究

高 普 王 洪 史彦芳 王明栋 贾潮微 陈 研 刘杏棉

（1 河北大学附属医院神经外科，河北 保定 071000；2 河北曲阳县人民医院，河北 曲阳 073100）

垂体腺瘤为来源于垂体前叶的良性肿瘤。随着影像及内分泌诊断技术的提高，其发病率有日渐增多的趋势。催乳素腺瘤是其中最常见的一种分泌性垂体腺瘤，约占垂体瘤的30%～40%。其中女性患者发病率比男性患者多5倍。2/3女性患者是微腺瘤，多在20～40岁，以高PRL血症的溢乳-闭经-不育三联征就诊。男性患者90%以上是大腺瘤，多在40～55岁间，因肿瘤压迫鞍区组织就诊，多表现为性欲减退，阳痿、体重增加、毛发稀少等。目前垂体催乳素瘤的发病机制仍不明确。因此我们对PRL瘤进行体外细胞培养，从而为研究PRL瘤的病因、发病机制，为诊断和治疗PRL瘤提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取河北大学医学院附属医院神经外科2009年10月至2011年10月住院经手术切除治疗的PRL瘤病例16例，其中男性6例，女性10例，年龄30～65岁（平均38.5岁），术前血清PRL水平检测及术后免疫组化染色均证实垂体PRL腺瘤。PRL瘤离体后即刻无菌取材，装入含Hanks培养液的无菌试管中。取肿瘤时尽量取生长活跃的部位，尽量去除正常组织。

1.2 主要试剂

Hanks液和含双抗的PRMI-1640培养液购自Beijing solarbio Science&Technology Co.Ltd。新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.3 培养过程

①取所须己消毒的培养用品置于净化工作台面，紫外线消毒20min。开始工作前先洗手，75%酒精擦试手；②在无菌条件下，选取手术切除的垂体PRL腺瘤组织，置于小平皿中，用Hanks反复冲洗2～3次，去除血液等杂质，用已消毒的眼科剪将垂体瘤剪碎；③用吸管将其转入含胎牛血清的PRMI-1640培养基中，在室温下加入0.25%胰酶消化酶消化约15min。5min摇动一次，以利于充分消化，肿瘤细胞分离；④在消化过程中见消化液混浊时，可吸出少许消化液在倒置显微镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即加入PRMI-1640终止消化；⑤每例标本按所取的的多少将细胞等分至1～3个细胞培养皿中；⑥采用悬浮细胞培养法，定时观察垂体腺瘤细胞的生长情况，定期换液，换下的培养液置于-20℃冰箱中保存，待进行激素水平测定。

1.4 统计学方法：

PRL实测值变化进行统计学分析，进行多个样本均数间比较。用SPSS16.0软件进行处理。

2 结 果

2.1 培养的PRL瘤细胞的特征 倒置相差显微镜下观察，原代培养的PRL腺瘤细胞呈椭圆形或梭形，24h后有部分PRL瘤开始半贴壁生长，大部分呈悬浮生长。于培养的约第10天开始，成纤维细胞数量开始增多，并逐渐取代PRL瘤细胞。

2.2 PRL瘤细胞功能测定：换下的培养液采用放射免疫方法检测。各例PRL腺瘤培养细胞PRL分泌量第1～5天逐渐增加，第6～8天达到高峰。测定结果显示培养的PRL瘤细胞在第7天功能状态最佳。免疫组织化学染色法检测培养细胞泌乳素（PRL）的表达，培养的PRL瘤细胞呈PRL阳性表达。

3 讨 论

垂体腺瘤是一种生长缓慢的颅内肿瘤，发病率约1/10万人，占须内肿瘤的10%。近十年来，垂体肿瘤的临床和基础研究随着科技的发展更加深入和迅速。放射免疫，免疫组化和各种内分泌激素及其的兴奋/抑制实验的应用，以及CT、MRI等影像学检查的进步，使垂体肿瘤的诊断准确性较过去以视野、视力的改变、明显内分泌症状和X线片上蝶鞍骨质的变化等诊断标准前进了一个时代。又由于分子生物学的迅速发展，使人们对垂体肿瘤的发生、发展及病理生理的认识不断深化，从而为临床诊断、治疗开辟了广阔的前景。

PRL腺瘤是垂体腺瘤中的一种最常见的类型，约占垂体瘤的30%～40%，它的治疗目前有三种方法：包括药物控制、手术切除和放射治疗。具体到每个患者，则要依据具体情况综合考虑何种治疗方法[1]。据文献报道[2,3]，垂体腺瘤的恶性程度大多数不高，且其培养的细胞不容易贴壁，只有极少数能够形成细胞系并传代培养，因此其培养较其他肿瘤困难。PRL腺瘤细胞的贴壁较生长激素（GH）腺瘤贴壁更困难，多呈悬浮生长[4,5]。PRL腺瘤细胞的生长伴随着成纤维细胞的成长，尤其培养的时间延长，成纤维细胞常与PRL腺瘤细胞同时混杂生长，时间越长，成纤维细胞生长越旺盛。因此排除成纤维细胞，得到纯化的PRL腺瘤细胞成为其中最关键的环节。成纤维细胞的生长状态与PRL腺瘤不同，多呈贴壁生长，因此我们采用悬浮细胞培养方式，这样就排除了成纤维细胞的干扰，而且有利于其生长过程中对其分泌的激素进行测定。

正常垂体激素的分泌是在下丘脑分泌的组释放激素和抑制激素双重调控下进行的，而且促释放激素占优势，因此脱离了下丘脑的控制、体外培养的正常垂体细胞激素分泌量随时间延长迅速下降。我们通过对PRL腺瘤细胞培养，并测定其激素分泌的特征发现培养的PRL瘤细胞在第7天功能状态最佳。通过本次试验研究，可以为以后治疗PRL腺瘤提供良好的试验基础，可以通过干预垂体腺瘤细胞，观察PRL腺瘤细胞的生长及激素分泌特征，为研究PRL腺瘤的发病机制、药物治疗及预后具有重要意义。

[1]赵继宗,周良辅,周定标,等.神经外科学[M].北京：人民卫生出版社,2007：405-419.

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