骨肉瘤化疗耐药机制及逆转治疗的研究进展

张燕 张俐 牛素生 刘俊宁

福建中医药大学骨伤学院，福建福州 350108

骨肉瘤化疗耐药机制及逆转治疗的研究进展

张燕 张俐 牛素生 刘俊宁

福建中医药大学骨伤学院，福建福州 350108

骨肉瘤是常见的骨源性恶性肿瘤，化疗是其重要的治疗手段，但肿瘤耐药性的存在，成为骨肉瘤复发和治疗失败的重要原因。明确其耐药机制，有效预防或逆转骨肉瘤耐药是目前临床亟待解决的问题。本文将对骨肉瘤耐药机制及其逆转策略的研究进展作一综述。

骨肉瘤；耐药机制；逆转

骨肉瘤是青少年最常见的一种骨源性恶性肿瘤，在原发性骨恶性肿瘤中发病率最高。单纯手术治疗其治愈率仅有15%～20%，伴随着新辅助化疗其5年生存率提高到70%左右[1]。然而对化疗药物的多药耐药（multidrug resistance，MDR）严重影响了其临床疗效和长期生存率。有数据显示复发患者生存率不足30%[2-3]。因此，研究骨肉瘤MDR发生机制，寻找有效地预防或逆转耐药的方法已成为目前骨肉瘤研究的热点和难点，也是临床亟待解决的问题。现对近年来国内外对骨肉瘤耐药机制及逆转研究现状予以简要概述。

1 骨肉瘤化疗的耐药机制

骨肉瘤化疗耐药的产生是多种耐药机制共同作用的结果，是多因素、多水平、多基因参与的复杂过程，主要与膜转运蛋白、细胞凋亡、细胞内解毒系统、肿瘤干细胞等有关。

1.1 细胞膜转运蛋白异常

1976年Juliano等首次提出跨膜转运蛋白的药泵作用是导致肿瘤细胞耐药的重要机制，后来被称为“经典MDR”。ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transportes，ABC transporters）超家族成员，包括P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp、ABCB1）、多药耐药相关蛋白（multidrug resistance associated protein，MRP1 ABCC1 and MRP2 ABCC2）、乳腺癌多药耐药相关蛋白（breast resistance protein，BCRP ABCG2）等，是目前公认的在骨肉瘤耐药中起重要作用的药泵蛋白[4]。这些蛋白与药物结合，通过三磷酸腺苷（ATP）供能，改变蛋白构象，将细胞内的抗肿瘤药物排出细胞外，从而降低细胞内药物有效浓度，导致肿瘤细胞耐药[5]。黄纲等[6]研究发现骨肉瘤对化疗不敏感与MDR1、P-gp表达有关。Celia等[7]发现骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性与MDR1表达水平密切相关，MDR1水平越高，则药物敏感性越低。而抑制ABCB1的表达可以抑制骨肉瘤耐药株中P-gp的表达，增加细胞内阿霉素的浓度，从而可以有效地抑制其耐药性[8]。

1.2 细胞凋亡调控异常

众多化疗药物通过诱导细胞凋亡达到杀伤肿瘤细胞的作用。但同时也可能诱发凋亡调节因子发生变化而产生耐药。凋亡相关蛋白异常表达或功能缺陷都将引起细胞对化疗药的耐受。Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白与凋亡前分子的比例决定细胞是否走向凋亡[9]。Bcl-2过表达将抑制大多数化疗药物所引起的靶细胞凋亡，吴小三等[10]利用RT-PCR及Westernblot技术对耐药前后的骨肉瘤细胞中的Bcl-2基因含量进行检测，结果发现Bcl-2基因及其表达蛋白在耐药细胞株MG63/R中表达明显高于敏感细胞株MG63。Zhao等[11]发现慢病毒介导的Bcl-2基因沉默后，可以使MG63耐药株的凋亡增加，同时对阿霉素的敏感性增加。

凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis protein，IAPs）家族是细胞内一类重要的凋亡抑制因子，包括XIAP、Hiap-1、Hiap-2、NAIP、Survivin、Apollon和Livin等，主要通过抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）来抑制细胞凋亡。其中目前研究较多的是Survivin蛋白与Livin蛋白。聂涛等[12]研究骨肉瘤中Survivin蛋白表达及其与P-gp、Bcl-2蛋白表达的相关性中发现Survivin在骨肉瘤中呈高表达，与P-gp表达有明显的一致性，与临床耐药密切相关。傅培荣等[13]通过检测骨肉瘤标本（观察组）及骨软骨瘤标本（对照组）中Survivin蛋白的表达，发现观察组Survivin蛋白的表达率明显高于对照组，且与病理分级、肺转移密切相关。而王井伟等[14]观察Survivin-siRNA转染MG63细胞后骨肉瘤MG63细胞对阿霉素、顺铂药物敏感性，发现Survivin-siRNA抑制Survivin的表达后，增强了骨肉瘤细胞对阿霉素、顺铂的敏感性。安贵峰等[15]采用基因重组技术研究发现与U2OS细胞、U2OS/neo细胞相比，U2OS/Livin细胞对阿霉素、环磷酰胺、顺铂等化疗药物的耐药性明显增强，表明Livin基因高表达是人骨肉瘤多药耐药的原因之一。

1.3 细胞内解毒系统

谷胱甘肽（glutathione，GSH）系统是细胞内解毒系统的关键组成部分。GSH在谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferaseπ，GST-π）的催化下与某些抗肿瘤药物形成复合物，成为MRP1的底物，被转运出细胞外，从而使细胞内的药物浓度降低，起不到杀伤细胞的作用；同时GSH可与抗肿瘤药物直接结合降低药物活性，清除蒽环类药物等产生的自由基，减轻其对细胞的损伤。据报道[16]，GST-π过表达的Saos-2细胞对氯胺顺铂及阿霉素耐药，而沉默该基因后，对上述两种药物的敏感性提高。Michela等[17]也发现对阿霉素和氨甲蝶呤交叉耐药的CDDP耐药株骨肉瘤细胞高表达GST-π。对骨肉瘤组织中GST-π、MRP1等表达检测发现，GST-π、MRP1与骨肉瘤的恶性程度呈正相关，为骨肉瘤耐药的重要原因之一[18]。

1.4 肿瘤干细胞

海伦·凯勒已悄悄起床，她摸到书桌前，打开昨天还未读完的盲文书，仔细摸着，摸着。天气尤寒，海伦的手不禁在微微打颤。时间总是过得飞快，天完全亮了，海伦迎来了一天中第一缕阳光，海伦笑了，笑得那样灿烂，像阳光一样。知识的满足和阳光的温暖，给海伦带来了慰藉。

肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）是近年来研究的一个热点。它具有干细胞的特点，即自我更新、无限增殖及分化潜能，在启动肿瘤形成和生长中起着决定性的作用[19]。CSCs大多处于静止期或休眠期，使得其对作用细胞周期的化疗药物不敏感。它还能增强DNA修复能力，上调ABC转运蛋白的表达，高表达抗凋亡基因，对化疗药物具有耐药性，在骨肉瘤化疗治疗过程中该类细胞逃避了化疗药物的毒性作用，一旦化疗药物作用消失，该类细胞可以通过自我更新、无限增殖使肿瘤复发转移[20]。Tang等[21]发现化疗能够使骨肉瘤中CSCs比例增加，且CSCs成瘤性增强。Mimeault等[22]认为，干细胞靶点表达缺失的现象可能是其能够逃脱某些药物作用的主要原因，干细胞由于长时间接触辐射或致癌物质而逐渐产生变异，而肿瘤干细胞也存在相同的机制，从而把耐药性传给子代肿瘤细胞引起耐药。Sara等[23]利用悬浮法培养人骨肉瘤细胞株MNNG/HOS，并通过流式分选、引导分化、Wester Blot、化疗药物敏感性等研究，证实通过悬浮培养法可以分选出CSCs细胞，且此类细胞除具有CSCs细胞的一般特性外，还对化疗药物具有抗药性。Virginia等[24]采用FASC，证实存在于骨肉瘤细胞中CD133+细胞具有较高的增殖能力，能够在无血清的培养基中形成克隆，同时高表达ABCG2。说明CD133+细胞具有CSCs细胞的特性。因此，CSCs成为肿瘤耐药的一个重要原因。

2 骨肉瘤耐药逆转策略

骨肉瘤耐药性是多因素、多水平、多基因参与的复杂过程，且相互交叉，相互影响。目前针对骨肉瘤耐药逆转的研究还处于探索阶段。

2.1 化学药物逆转剂

研究较早，研究最为广泛的一种逆转MDR的策略。此类药物的作用机制主要是：①竞争性P-gp抑制剂，它主要作为P-gp底物与细胞毒性药物竞争性地结合于外排泵上，从而减少化疗药物的外排，达到治疗的有效浓度[25]。②非竞争性抑制剂，通过与底物蛋白不同区域结合，改变底物蛋白的构型，使其活性位点不能被活性底物识别，阻止ATP水解，减少化疗药物从细胞内泵出。但此类药物或是与ABC转运蛋白亲和力低，需要增加剂量，才能达到疗效，与此同时其毒性增加，限制了临床使用，或可能干扰化疗药物的清除或代谢，显著提高化疗药物的血药浓度，从而导致副作用增加[26]。

2.2 基因治疗逆转

肿瘤细胞MDR的产生与某些基因表达不协调，导致某些与MDR相关的蛋白质和酶异常相关，因此在基因水平寻找逆转MDR的方法，将有助于MDR问题的解决。随着反义核酸技术、核酶技术、RNA干涉技术、反义RNA技术等的方法不断完善，基因治疗已经广泛应用于肿瘤耐药性逆转研究。

核酶技术（Ribozyme）：核酶正常存在于细胞内并调控基因表达小分子RNA，具有RNA限制性内切酶活性，能特异性与靶RNA特定位点结合，序列切割靶酶RNA，抑制基因表达。在逆转肿瘤MDR过程中，核酶可针对MDR1mRNA的特定位点进行切割，使P-gp无法表达，达到逆转MDR的目的。

RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）是指由短双链RNA诱导的同源RAN降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表现型缺失的现象。小分子干扰RNA（small interference RNA，siRNA）是长度为21～23个核苷酸的双链RNA，可特异性识别同源的mRNA，并切割其中与siRNA反义链互补的区域，从而抑制靶基因的表达。RNAi具有抑制效果确切，且针对性强、不良反应少的特点，使得其应用于逆转MDR[27]。车彪等[28]将成功构建的针对stathminmRNA的siRNA真核质粒经脂质体转染LM8骨肉瘤细胞，观察多烯紫杉醇、顺铂作用后细胞的化疗敏感性，结果显示stathmin基因沉默能明显增加多西紫杉醇对骨肉瘤LM8细胞的化疗敏感性并协同诱导细胞凋亡。

2.3 纳米给药系统逆转MDR

纳米给药体系是指直径在10～1 000 nm之间的给药体系，具有提高药物稳定性、药物缓释和控释的作用。在肿瘤治疗过程中，纳米给药系统通过形成载药纳米复合物，可以拮抗和抵消肿瘤细胞主动外排药物的作用，从而提高肿瘤细胞内药物浓度。Michiro等[8]以葡聚糖为基础的聚合物纳米粒子作为MDR1 siRNA的载体，作用于骨肉瘤耐药株，可以通过限制ABCB1（MDR1）表达，达到逆转其耐药性的目的。

2.4 中医药逆转MDR

中药如人参、川芎、大黄等具有钙通道阻滞作用，通过大量实验研究发现中药具有逆转MDR的作用。人参皂苷单体Rb1是三七总皂苷的主要成分，可以逆转白血病多药耐药细胞系（K-562/HHT）的多药耐药性，并血液学毒性较低[29]。双苄基异喹啉类生物碱[30]是具有钙通道阻滞作用的中药单体，在体外实验中有MDR逆转活性，其作用机制与异博定相似，均有膜调节作用。王进等[31]研究显示粉防己碱能逆转骨肉瘤细胞系的多药耐药性，其效果明显优于维拉帕米和环孢霉素A，逆转的机制在于抑制耐药系细胞膜上P糖蛋白的功能，而对其表达水平无影响。肖扬等[32]用姜黄素作用于U2OS/ADM，MTT显示姜黄素能增加不同浓度阿霉素对U2OS/ADM的抑制作用，FCM结果显示，姜黄素能增加阿霉素对U2OS/ADM的细胞毒性作用，且呈剂量依赖关系，可有效逆转U2OS/ADM细胞的多药耐药现象。对单味中药的逆转MDR作用的研究，现局限于单味中药的某种成分上，忽视了中医理论指导下中药复方对MDR逆转的功效。中医中药是一个完整的整体，在临床应用很少是单味药物应用的，更多的是在中医整体理论指导下的组方用药。

中药复方在骨肉瘤的防治基础研究中现在相对较少，但有着广阔的发展前景，因为其能够体现出中医的整体观念、辨证论治的特色。石宇雄等[33]发现参麦注射液能逆转人成骨肉瘤多药耐药细胞株R-OS-732，提高细胞内化疗药物的浓度，增加化疗药物的毒性作用。应用骨癌通泰方含药血清干预人成骨肉瘤耐药细胞R-KHOS，用RT-PCR检测MRP基因的表达，发现骨癌通泰方能够下调MRP基因的表达，提高骨肉瘤化疗曾敏效果[34]。

3 展望

目前对骨肉瘤MDR产生的机制研究已经取得了较大进展，但仍存在一定争议，尚未完全明确其确切的机制。已经开发的耐药逆转药物因存在较多的不良反应，限制了其在临床的应用。骨肉瘤MDR的发生是一个多因素参与的复杂过程，利用中药复方的多种药物协同作用，调动机体内在的抗肿瘤能力，增强骨肉瘤对化疗药物的敏感性，开发出可以逆转骨肉瘤MDR的有效方剂，将有助于提高骨肉瘤的临床疗效。

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Research progressof drug resistancemechanism on osteosarcoma chemotherapy and reverse treatment

ZHANG Yan ZHANG Li NIU Susheng LIU Junning
College of Orthopedics,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fujian Province,Fuzhou 350108,China

Osteosarcoma is a sortofmalignant commonly-seen osteogenic sarcomas,a better treatment for it is chemotherapy.However,tumor drug resistance is a key factor causing recurrence of osteosarcoma and treatment failure.Therefore, clearly understand its drug resistancemechanism and further effectively prevent or reverse osteosarcoma's drug resistance are urgent problems needed to be solved in current clinic.The article is going to review on drug resistancemechanism of osteosarcoma and strategy for its reversal.

Osteosarcoma;Drug resistancemechanism;Reverse

R735.340.2

A

1673-7210（2012）11（b）-0023-03

国家自然科学基金（青年项目）（项目名称：片仔癀对骨肉瘤多药耐药性影响的实验研究；批准号：30901916）。

2012-04-19 本文编辑：张瑜杰）