大肠杆菌检验方法的探究与分析

苏丽晶

(内蒙古呼伦贝尔市海拉尔区人民医院检验科 内蒙古呼伦贝尔 028000)

呋喃唑酮片一般适用于大肠杆菌或痢疾杆菌引发的肠炎和菌痢等疾病的治疗,对大肠杆菌具有较强的抑菌和杀菌能力,属于硝基呋喃类抗菌药物[1～2]。应用卫生学中常用的处理样品的检查方法难以检出呋喃唑酮片中大肠杆菌,这是检验工作中一个长期困难。本研究分别应用一次离心法、离心滤膜法、离心双重滤膜结合法进行呋喃唑酮片大肠杆菌检验,观察对比大肠杆菌检出率情况,取得了满意的检出效果,现将其具体过程与结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取规格为0.10g/片的呋喃唑酮片(国药准字H52020295,贵州省科晖制药厂),大肠杆菌CMCC(B)【44102】、孔径规格分别为3.0、1.2μm和0.45μm的混合纤维素酯微孔滤膜、伊红美蓝琼脂、胆盐乳糖增菌液、大肠杆菌生化反应培养基均为中国药品生物制品检定所提供。

1.2 检测方法

一次离心法:将呋喃唑酮片与大肠杆菌CMCC制成供试液,离心后将上清液取出进行大肠杆菌的检测。离心滤膜法:先将呋喃唑酮片与大肠杆菌CMCC制成供试液,进行离心,离心后将上清液取出后采用孔径为0.45μm微孔滤膜进行过滤,过滤后将溶液取出进行大肠杆菌的检测;离心双重滤膜法:先将呋喃唑酮片与大肠杆菌CMCC制成供试液,进行离心,离心后将上清液取出后,依次采用孔径1.2μm的微孔滤膜与孔径0.45μm的微孔滤膜进行过滤,或者依次采用孔径3.0μm的微孔滤膜与孔径0.45μm的微孔滤膜进行过滤,过滤后将溶液取出进行大肠杆菌的检测。过滤法将0.45μm的滤膜取出,分别将3种方法得到的检测溶液中加入胆盐乳糖增菌液中进行增菌操作,时间为48h,浑浊、产气判定为检出大肠杆菌。再进行伊红美蓝琼脂平板分离检验,观察菌落的长出情况。本实验所用离心机上海安亭离心机TDL-5-A,离心半径为16cm,转速为5000转/min。

1.3 检出判定

仔细观察胆盐乳糖增菌液的情况,如果胆盐乳糖增菌液浑浊、产气判定为检出,如果胆盐乳糖增菌液无浑浊、未产气则判定为未检出;伊红美蓝琼脂平板经过7～14d的培养后观察大肠杆菌的菌落生长情况,如果伊红美蓝琼脂平板分离有典型大肠杆菌菌落长出判定为检出[3],如果伊红美蓝琼脂平板分离没有典型大肠杆菌菌落长出则判定为未检出。

表1 不同检验方法大肠杆菌检出结果对比

表2 人工污染5d样品大肠杆菌检出情况

1.3 统计学分析

全部数据采用SPSS13.0统计学软件进行处理,组间比较以t和χ2检验,P＜0.05为差异有显著性,具有统计学意义。

2 结果

分别应用一次离心法、离心滤膜法、离线双重滤膜法进行呋喃唑酮片大肠杆菌的检验。其中一次离心法检验中,胆盐乳糖增菌液呈现微浑,伊红美蓝琼脂平板分离没有菌落长出,检查结果为没有检出;离心滤膜法检验中,胆盐乳糖增菌液呈现澄清,伊红美蓝琼脂平板分离没有菌落长出,检查结果为没有检出;离心双重滤膜法检验中,胆盐乳糖增菌液呈现浑浊、产气,伊红美蓝琼脂平板分离有典型大肠杆菌菌落长出,检查结果为检出。应用离心双重滤膜法检验的检出效果,明显优于应用一次离心法检验、离心滤膜法检验的效果,组间差异显著(P＜0.05),具有统计学意义。3种方法具体检出情况详见表1。采用6批加入大肠杆菌药品样本进行人工污染5d,应用离心双重滤膜法进行大肠杆菌检验,6批样品胆盐乳糖增菌液均呈现浑浊、产气,伊红美蓝琼脂平板分离均有典型大肠杆菌菌落长出。样品大肠杆菌阳性检出率为100%。具体人物污染样品大肠杆菌的检出状况详见表2。

3 讨论

大肠杆菌的检验方法有很多种,其中一次离心和二次离心法最为常。多种药物在一次离心或者二次离心之后,溶液中的药物浓度则会降至药物的最低抑菌浓度之下。而对于采用离心法不能使药物的浓度降至最低抑菌浓度之下的药物,可以采用0.45μm孔径的滤膜进行过滤,多数药物于过滤之后,溶液中的药物浓度则会降至药物的最低抑菌浓度之下。而对于采用0.45μm孔径的滤膜进行过滤后,药物的微量残留所达到的浓度也比药物的最低抑菌浓度高的药物,则可以使用离心双重滤膜法进行过滤。而对于呋喃唑酮而言,虽然呋喃唑酮在水中的溶解度仅为40mg/L,但于胆盐乳糖增菌液中,呋喃唑酮的最低抑菌浓度为0.01mg/L,经过一次离心,抑菌浓度均无法低于0.01mg/L。在应用离心滤膜法后,因为供试液经0.45μm孔径的滤膜进行过滤时有一定残留,也会导致胆盐乳糖增菌液中呋喃唑酮浓度比最低抑菌浓度0.01mg/L高,进而使大肠杆菌不能繁殖。本研究中应用的离心双重滤膜法,能够有效去除溶解于水中的少量呋喃唑酮,同时将离心后上清液中的呋喃唑酮残留拦截在1.2μm孔径与3.0μ孔径的滤膜中,保证0.45μm孔径的滤膜上呋喃唑酮较少,进而降低胆盐乳糖增菌液内呋喃唑酮的浓度,提高大肠杆菌的阳性检出率。人工污染的大肠杆菌样品在5d后能够全部检出,也能够为离心双重滤膜法在检验过程中对于大肠杆菌在胆盐乳糖增菌液的繁殖没有影响提供佐证[4]。

综上所述,离心双重滤膜法能够有效解决呋喃唑酮在胆盐乳糖增菌液中浓度过高的问题,应用离心双重滤膜结合法进行呋喃唑酮片大肠杆菌的检验,操作简单,检出率高,值得临床上应用推广。

[1] 崔红华.大肠杆菌的快速检验研究[J].长春中医药大学学报,2007,23(3):73.

[2] 巨煜华.泮托拉唑联合克拉霉素、呋喃唑酮治疗幽门螺杆菌阳性消化性溃疡60例临床观察[J].内科,2011,6(5):440～441.

[3] 张海平,杨天鸣,张志海,等.吡哌酸片大肠杆菌检验方法的探索[J].卫生职业教育杂志,200,21(6):85.

[4] 赵明莲.去除呋喃唑酮片抑菌作用的方法探讨[J].中国药事,1998,12(5):288～289.