抵挡汤早期干预对2型糖尿病模型大鼠大血管病变 C D68、MCP-1、E-选择素的影响＊

常 柏，甄 仲，潘从清，孟 东，常宝成，仝小林△

(1.天津医科大学代谢病医院，天津 300020;2.中国中医科学院广安门医院，北京 100053)

糖尿病大血管病变是糖尿病患者致死、致残的主要因素。据报道在我国糖尿病患者中，糖尿病发病5年、5～10年和10年以上者，下肢血管病变发病率分别为22.6%、23%和66.7%[1]，单纯控制血糖并不足以阻止大血管病变的发生和进展[2]。目前糖尿病大血管病变的机制尚不完全明确，一般认为动脉粥样硬化(AS)为其主要病理基础。而新近研究则表明，AS可能与炎症有关，而不是单纯的由于脂质沉积所致[3]。炎症反应在AS的发生、发展，到最后斑块表面破裂并发血栓形成的所有阶段均发挥了作用[4]。为探讨高血糖状态下抵挡汤早期干预对糖尿病大血管的炎性细胞趋向性的影响，我们开展了动物实验研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性Vistar大鼠140只，4周龄，体重100.30g±2.19g，由天津实验动物中心提供(动物合格证号为SCXK津2005-001)。

1.1.2 药物 抵挡汤组成:桃仁10g，水蛭10g，虻虫10g，大黄6g，购于天津中医药大学第一附属医院药剂科，按传统工艺制备水煎剂，减压浓缩至浓度为1g/ml，4℃保存备用。

马来酸罗格列酮(文迪雅)为葛兰素史克公司生产(4mg/片，产品批号国药准字H20020475)。阿托伐他丁钙片为辉瑞制药有限公司生产(10mg/片，批号国药准字J20070060)。

1.1.3 主要试剂 I抗MCP-1 IgG多克隆抗体:美国Abbiotec公司;I抗MIP-1αIgG多克隆抗体:美国SANT CRUZ公司;I抗E-选择素IgG多克隆抗体:美国CST公司;SP免疫组化试剂盒:北京中杉金桥生物技术有限公司;大鼠血清可溶性E-选择素EIA试剂盒:美国R＆D公司，博海生物试剂有限公司提供;全自动酶联免疫分析仪:芬兰Thermo Labsytoms公司。

1.2 方法

1.2.1 造模与分组 wistar大鼠140只，适应性喂养1周后，随机抽取20只作为正常对照组(NC组)，给予标准饲料喂养，其余120只为造模组给予高脂饲料喂养。8周后，空腹眼眶采血测空腹血糖和胰岛素计算胰岛素敏感指数ISI=Ln【(FBG)(FINS)】-1，判断动物出现胰岛素抵抗后，随机选取造模组20只大鼠分为中药早期干预组(A)，按照人鼠等效剂量予抵当汤生药2.3g/(kg·d)灌胃，灌胃4周后开始造模。A组与造模组其他大鼠24h禁食不禁水，尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)30mg/kg(用前以PH4.2的0.1mol/L枸橼酸缓冲液配成1%的浓度)。正常对照组仅注射相同剂量的枸橼酸缓冲液作为对照。3d后尾静脉采血测血糖，随机血糖高于16.7mmol/l确定造模成功。

NC组正常对照组(n=20只)，前期实验已造模成功的110只大鼠，除A组中药早期给药组(n=18只)，其余大鼠按血糖、体重随机分为B组中药中期给药组(n=18只)、C组中药晚期给药组(n=18只)、D组罗格列酮组(n=19只)、E组阿托伐他汀组(n=18只)、DM组糖尿病模型组(n=19只)4组，其中NC组为正常对照组。

1.2.2 实验干预 所有给药组均以体表面积折合成等效剂量给药，A组中药早期给药组，造模4周前给药，给予抵当汤生药2.3g/kg/d灌胃;B组中药中期给药组于成模后给予抵当汤灌胃，剂量同A组;D组罗格列酮组和E组阿托伐他汀组成模后给药，E组阿托伐他汀组的灌胃剂量为0.89mg/kg/d;D组罗格列酮组的灌胃剂量为0.36mg/kg/d，C组抵挡汤晚干预组于糖尿病模型成模后4周后给药，给药剂量同A组，均灌胃至造模后24周实验结束取血取材。

1.2.3 指标检测 大鼠隔夜禁食。内眦静脉采血10ml分离血清，－20℃保存备测;戊巴比妥麻醉下取约1cm胸主动脉，固定、包埋、切片采用免疫组化检测MCP-1、CD68及E-选择素蛋白表达的表达，酶联免疫法测试血清MCP-1、E-选择素的表达。

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件统计分析，计量数据用均值±标准差表示，各组之间比较用单因素方差分析(One way ANOVA)，2组之间比较采用t检验，方差不齐者用t检验，P＜0.05为差异有显著性意义，P＜0.01为差异有非常显著性意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血糖的变化

表1显示，模型组与正常组相较血糖明显升高，且有统计学差异，提示造模成功。抵挡汤干预各组血糖无显著差异(P＞0.05)。与模型对照组比较，抵挡汤早、中、晚期组和辛伐他汀组血糖差异性无统计学意义(P＞0.05)，提示中药和辛伐他汀无明显降糖作用。与模型对照组比较，罗格列酮组血糖明显降低(P＜0.05)。

表1 各组大鼠血糖的变化(mmol/L)

表1 各组大鼠血糖的变化(mmol/L)

注:模型组与正常组比较:#P＜0.05，治疗组与模型组比较:*P＜0.05

组别 给药0周 给药12周 给药24周正 常 组5.34±1.24 5.96±1.31 5.85±1.08模 型 组 25.95±3.46# 28.33±4.36# 27.66±3.11#抵挡汤早期组 27.8±4.68 27.05±5.24 26.7±6.64抵挡汤中期组 27.29±6.62 25.38±8.25 26.12±8.25抵挡汤晚期组 28.15±5.57 24.46±5.1 25.48±6.23罗 格 列 酮 组 27.95±3.46* 14.95±3.58* 10.95±3.64*阿托伐他汀组28.02±2.65 27.29±6.62 26.12±8.25

2.2 抵挡汤早期干预对2型糖尿病胸主动脉CD68、MCP-1 E-选择素的影响

表2显示，糖尿病模型组与正常组比较，CD68、MCP-1、E-选择素的表达均升高，差别具有统计学意义(P＜0.05);除抵挡汤晚期给药组外，各干预组与糖尿病模型组比较，CD68、MCP-1、E-选择素均降低，差别具有统计学意义(P＜0.05);中药早期给药组与西药组比较，CD68、MCP-1、E-选择素的表达均降低，差别具有统计学意义(P＜0.05)，抵挡汤早期给药组与抵挡汤中期给药组比较无显著差异。

2.3 抵挡汤早期干预对2型糖尿病大鼠血清MCP-1 E-选择素的影响

表3显示，模型组较正常组MCPI-1水平升高(P＜0.05)，抵挡汤早期干预组、抵挡汤中期干预组、阿托伐他汀钙组较模型组血清MCP-1水平下调(P＜0.05)。模型组血清E-选择素水平较正常组上升，抵挡汤早期干预组、阿托伐他汀钙组较模型组表达水平下调(P＜0.05)。

表2 各组主动脉CD68、MCP-1、E-选择素的表达水平

表2 各组主动脉CD68、MCP-1、E-选择素的表达水平

注:模型组与正常组比较:#P＜0.05，治疗组与模型组比较:*P＜0.05，罗格列酮、阿托伐他汀钙组与抵挡汤早期治疗组比较:▲P＜0.05

组别 CD68 MCP-1 E-选择素正常对照组12.00±3.51 3.53±1.23 8.77±2.26糖 尿 病 模 型 25.00±2.07# 15.34±2.09# 31.00±8.22#抵挡汤早期 5.03±0.52* 3.23±0.66* 8.33±1.57*抵挡汤中期 5.67±0.43* 5.50±1.44* 9.67±1.40*抵 挡 汤 晚 期 23.00±5.00 10.67±1.24 31.67±1.62罗 格 列 酮 组 10.13±3.86＊▲ 6.67±4.04＊▲ 22.80±8.89＊▲阿托伐他汀组 13.33±3.20＊▲10.87±0.15＊▲ 23.71±6.96＊▲

表3 各组血清MCP-1、E-选择素的表达水平(ng/ml)

表3 各组血清MCP-1、E-选择素的表达水平(ng/ml)

注:模型组与正常组比较:#P＜0.05，治疗组与模型组比较:*P＜0.05

组别 E-选择素MCP-1正常对照组3.85±0.12 70.73±12.01糖尿病模型 10.24±0.46# 89.23±12.22#抵挡汤早期 3.59±0.22* 69.45±13.95*抵 挡 汤 中 期 4.990±0.19 73.27± 2.480*抵 挡 汤 晚 期 5.21±0.61 76.94± 8.57罗格列酮组 4.52±0.94 86.51±22.08阿托伐他汀组 3.77±0.11* 70.45±12.46*

3 讨论

MCP-1属于CC型趋化因子，是作用于单核细胞的特异趋化蛋白，是引起单核细胞趋化迁入血管内膜下的主要趋化因子;病理条件下，动脉壁细胞(内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞)产生大量MCP-1，而MCP-l可刺激单核细胞分泌多种细胞因子[5];E-secletin表达于细胞因子活化的内皮细胞表面，正常血管内皮细胞不表达或低表达E-secletin，它的表达主要局限于受到炎性细胞因子刺激后活化的内皮细胞，是介导白细胞与内皮细胞黏附分子起始阶段的重要因子，血清中sE-selectin的水平可反映血管内皮细胞的激活状态[6]。CD68是反应单核/巨噬细胞的特异性抗原，均参与AS的发生并起到重要作用。本研究表明，抵挡汤干预后，主动脉CD68、MCP-1、E选择素表达明显下降，血清MCP-1、E选择素也有不同程度下调，表明中药抵挡汤具有一定的改善炎症反应的作用。

糖尿病大血管病变属于中医“消渴”变证，瘀血贯穿始终。近年来，DM的瘀血病机日益受到重视，认为瘀血为贯穿DM病程始终的重要病机。中医学认为，糖尿病血管病变的发生是因消渴日久、气阴两虚，以致气虚行血无力，阴虚脉道失濡而滞涩，终致瘀血阻滞脉道而成。因此，气阴两虚、瘀血阻滞是糖尿病血管病变发生、发展的基本病机。现代医学认为，炎症过程的中心环节是血管反应。从传统中医理论看，低度的血管炎症必然导致瘀血内停。低度炎症过程中，血管中和血管外多种有形成分的聚集，如血小板黏附、聚集及血栓形成单核细胞转化为泡沫细胞，继而在内皮下沉积、结缔组织形成、纤维斑块、平滑肌细胞增生及免疫功能调节失常等均是中医瘀血的具体表现[7]。抵挡汤是治疗蓄血实证的经典破血逐瘀名方，具有活血通络、逐瘀攻下之功效。方中水蛭咸苦性平，入肝、膀胱二经，专攻逐恶血瘀血、破血癥积聚;虻虫破血逐瘀之力更峻;大黄荡涤邪热、导瘀下行;桃仁破血行血[8]。近来研究表明，本方对多种与血管性疾病相关的疑难疾病有较好的治疗效果，并可改善血管内皮功能。本研究则在前期临床及实验研究基础上，进一步表明抵挡汤对糖尿病大鼠大血管病变具有独立于降糖作用的干预作用。本实验结果表明，抵挡汤早期干预，可能预防和延缓糖尿病大血管病变-AS的进展，为心脑血管疾病和周围血管疾病级预防提供了有益的思路。

今后的研究中，我们将进一步开展系列研究，以期较深入地从炎症角度探讨中药抵挡汤对糖尿病大血管病变的作用机制。

[1]M Lorenzi，E Cagliego and S Toledo.Glucose toxicity for human endothelial cells in culture.Delayed replication，disturbed cell cycle，and accelerated death[J].Diabetes，1985，34(7):621-627.

[2]Emofsson，Siegbann A.Platelet-derived growth faetor-BB and monoeyte chem-Otaetie Protein 1 induce human PeriPheral blood monoeytes to express tissue faetor[J].Throlnb Res，1996，83:307-320.

[3]Ross，R.Atherosclerosis-An Inflammatory Disease[J].New England Journal of Medicine，1999，340(2):115-126.

[4]Shah，P.Plaque disruption and thrombosis Potential Role of Inflammation and Infection[J].Cardiology Clinics，1999，17(2):271-281.

[5]Cominacini L，Fratta PA，Garbin U，et al.E-selectin plasma concentration is influenced by glycaemic control in NIDDM patient，possible role of oxidative stress[J].Diabetes logia，1997，40(5):584-589.

[6]张红敏，谢春光，陈世伟.动脉粥样硬化、2型糖尿病等疾病发病学说中低度炎症的中医病理探讨[J].中医杂志，2005，46(2):83-85.

[7]王珍，罗爱鄂.抵挡汤加味治疗子宫内膜异位症80例[J].广西中医药，2009，32(1):19-20.

[8]Unnikrishnan， A. Intensive blood-glucose control with sulphonylureas or insulin compared with conventional treatment and risk of complications in patients with type 2 diabetes(UKPDS 33)[J].Lancet.1998，352:837-853.

[9]杨奇云，虞舜.抵挡汤临床应用近况[J].辽宁中医药大学学报，2010，12(5):31-33.

[10]张艳慧，蔡冀民，宋爱华.抵挡汤对血脂异常大鼠内皮功能的影响[J].中药药理与临床，2007，23(2):5-7.