柴胡疏肝散对阿尔茨海默病大＊鼠海马CA1区超微结构的影响

赵唯贤，李高申，薛红莉，黄显峰，裴 瑞，李宁宁，王 黎

(1.河南职工医学院，郑州 451191;2.黄河科技学院，郑州 450006)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s diseas，AD)即老年性痴呆，是一种以进行性认知障碍和记忆能力损害为主的中枢神经系统退行性疾病。随着人口的老龄化，带来了AD患病率的上升，对社会和家庭造成了沉重的负担，因此研究高效低毒的药物防治AD，成为医学科研人员的一项艰巨任务。本课题通过观察柴胡疏肝散对大鼠海马CA1区超微结构的影响，初步探讨疏肝理气方剂在AD治疗中的意义，以期为筛选有效抗AD中药提供新的探索方向。

1 材料

1.1 动物

清洁级SD雄性健康大鼠(鼠龄5～6个月)48只，体重300g±20g，由河南省实验动物中心提供(许可证号SCXK(豫)2010-0002)。

1.2 药物

1.2.1 制备 每日7∶00将柴胡疏肝散和脑力宝2组处方各称取120g、90g分放入2只1000 mL瓷杯中，各加500 mL、400 mL纯净水浸泡30 min，放于煤气炉上加盖旺火加热至水沸，改微火煎煮30 min，煎后的药液过滤倒入另2只净瓷杯中;重将煎后的药物分别加水400 mL、300 mL，再次加盖旺火煮沸，微火煎煮20 min，过滤倒出与第一次煎药液混合，加热浓缩药液至规定浓度，分装放至常温备用。

1.2.2 组成及配比 柴胡疏肝散组成:柴胡、枳壳、白芍、陈皮、香附、川芎、甘草，各药间质量比2∶1.7∶1.7∶2∶1.7∶1.7∶1，柴胡疏肝散低、高剂量浓度分别为1.2 g·mL－1;脑力宝组成:远志、熟地、五味子、地骨皮、菟丝子、茯苓、石菖蒲、川芎，各药间质量等比，浓度为2 g·mL－1，均由我院科研科提供。

1.3 试剂仪器

D-半乳糖(D-gal，国药集团化学试剂有限公司，F20110318)，Aβ1～42(Sigma公司，A-1010)，2H-蓝星B型脑立体定位仪(安徽淮北正华生物仪器设备有限公司生产)。超薄切片机(型号LKBV)、透射电镜(日本电子，JEM-1400)。

2 方法

2.1 分组

将大鼠适应性喂养3 d后，随机分为空白组(A组)、生理盐水组(B组)、模型组(C组)、疏肝低剂量组(D组)、疏肝高剂量组(E组)、补肾组(F组)共6组，每组8只。大鼠4只/笼，饲养于清洁级动物房，光照节律12L∶12D(6∶00～18∶00)，室内温度控制在22℃～24℃，相对湿度保持在30%～40%，自由饮食饮水。

2.2 模型制作

采用D-gal腹腔注射(ip)和Aβ双侧海马注射联合造模[1]。(1)用生理盐水将D-gal稀释成10 g·L－1溶液，自造模第1天始每天上午9∶00～10∶00，对C、D、E、F各组大鼠ip1轮次，100 mg·kg－1;B组ip等体积的生理盐水，各组共计ip42 d;(2)用无菌生理盐水事先将Aβ1～42稀释成10 g·L－1，在37℃温箱中孵育7 d，使其变成为凝聚态的Aβ。自D-gal造模结束的次日，大鼠经6%水合氯醛(0.6 g·kg－1)麻醉后，固定于脑立体定位仪上，常规消毒皮肤，正中矢状切口，选择双侧海马CA1区作为注射点，前囟向后3 mm，中线旁开2.2 mm处，分离骨膜，用牙科钻钻开颅骨暴露硬脑膜，微量注射器垂直进针2.8 mm，将Aβ1～42溶液1μL缓慢注入，留针5 min保证溶液充分弥散，然后缓慢撤针，用灭菌医用骨蜡填补骨孔，缝合切口，碘伏消毒，青霉素钠注射每只8万U预防感染，每日1次，连用3 d，常规饲养;B组海马注射等体积灭菌生理盐水，方法同上。

2.3 药物干预与剂量

A组、C组不进行药物干预，B组选用生理盐水10 mL·kg－1，D组、E组分别选用低、高剂量的柴胡疏肝散10，20 g·kg－1(均为10 mL·kg－1)，F组选用脑力宝20 g·kg－1(10 mL·kg－1)，于Aβ造模后的第9天，每天上午9∶00各灌胃(ig)1轮次，连续进行28 d。

2.4 水迷宫行为学检测

各组分别自Aβ造模的第5天(ig干预前)和第37天(ig干预结束后的次日)各进行水迷宫行为学检测1轮(每天1次，连续3 d)，实验在每天上午9∶00进行。方法:将大鼠自第Ⅰ～Ⅳ4个象限放入，分别记录寻找安全平台的时间，取各组大鼠各象限连续3 d测得时间的平均值进行统计分析。

2.5 取材及观察

在ig干预结束后的第4天，每组随机选取3只大鼠6%水合氯醛行腹腔麻醉(0.6 g·kg－1)，打开胸腔，经心尖部灌注预冷的生理盐水400 ml，20 min左右灌流完毕，将灌注液改用4%多聚甲醛400 ml，灌注时间1.5 h内。断头、组织钳打开颅顶，剪开脑硬膜取出海马，4%戊二醛固定2 h以上，4℃保存，常规制备，超薄切片机，Leica EMUC-7超薄切片，透射电镜观察CA1区超微结构。

3 结果

3.1 水迷宫成绩

表1显示，①仅造模手术对大鼠智力影响较小，灌胃刺激也不会给大鼠的记忆功能造成影响;②ig给药前经Aβ造模的C、D、E、F各组与空白组比较差异明显(P＜0.05)，提示本次造模成功;③ig后E组和F组与同组ig前及与同期的模型组比较，均明显缩短了迷宫寻找平台时间(P＜0.01)，ig后D组与ig前及同期的模型组比较，迷宫寻找平台时间变化不甚明显。

表1 各组大鼠水迷宫寻找平台时间的比较

表1 各组大鼠水迷宫寻找平台时间的比较

注:与空白组比较:1)P＜0.01;与灌胃前及与同期模型组比较:2)P＜0.01;与疏肝低剂量组比较:3)P＜0.01(表3同)

组别 造模第5天(给药前)造模第37天(给药31 d后)空 白 组A 11.06±2.30 9.70±2.89生理盐水组B 11.44±2.56 10.47±2.84模 型 组C 17.31±3.681) 17.41±2.931)疏肝低剂量组D 16.93±3.851) 14.52±2.81疏肝高剂量组E 17.34±3.351) 12.78±2.541，2)补 肾 组F 17.79±2.251) 14.11±2.661，2)

3.2 透射电镜

空白和生理盐水组，电镜下可见海马神经突触前后膜均一，厚度适中，突触前膜内的突触小泡清晰可见，突触间隙清晰;线粒体大小及形态正常，线粒体膜、脊完整，内嵴清晰可见，基质均匀(图1、2)。模型组电镜下神经细胞形态破坏，结构紊乱。突触密度降低，且均匀不一，突触间隙变小不清，突触小泡数量减少;游离核蛋白体减少，线粒体膜不完整，线粒体嵴模糊(图3)。疏肝低剂量组神经元结构基本正常，突触前膜内突触小泡较清晰，突触间隙清晰;线粒体膜基本完整，线粒体嵴较清晰(图4)。疏肝高剂量组神经元结构正常，突触前膜内突触小泡、突触间隙清晰;线粒体膜完整，线粒体嵴清晰可见(图5)。补肾组神经元结构正常，突触膜增厚，突触间隙清晰，突触小泡数量基本正常，线粒体膜基本完整，线粒体嵴较清晰(图6)。

图1 空白组(30000×)

图2 生理盐水组(30000×)

图3 模型组(30000×)

图4 疏肝1组(30000×)

图5 疏肝2组(50000×)

图6 补肾组(30000×)

4 讨论

AD患者的主要病理学特征是在脑中形成神经原纤维缠结和大量的老年斑以及弥漫性脑萎缩。由于神经原纤维缠结的主要成分是异常过度磷酸化的微管相关蛋白tau，而老年斑的主要成分是β淀粉样多肽(Aβ)，因此，国外对AD研究的主流方向主要集中在tau和Aβ两个方面[1]。

线粒体形态结构和功能的改变是导致AD能量代谢障碍的重要因素和关键环节，线粒体损伤使Aβ的产生增加，又进一步对线粒体产生损伤[2]，从而使神经元退行性变化不断加重。这可能是导致AD临床症状不断恶化的原因之一，保护或改善线粒体的结构和功能，将有利于AD症状的改善和恢复。

中医认为，肝主藏魂，魂是阳之精、气之灵，魂与神有密切的联系，对心理活动会产生较大影响。肝又主谋虑、主持思虑等思维活动。清·陈士铎指出:痴呆“大约其始也，起于肝气之郁。”因此，理论上支持疏肝理气法在改善记忆、认知能力障碍上的治疗作用，部分疏肝方剂的实验研究[3-5]也显示了在调节记忆、认知方面的作用。药理研究表明，柴胡能改善脑细胞代谢和脑循环，延缓衰老引起的活性氧自由基的反应速度，使衰老引起的神经功能减退得到恢复[6]。白芍总苷能改善东莨菪碱诱发的小鼠空间识别障碍，对小鼠学习记忆获得不良有改善作用。当归可改善痴呆模型大鼠脑耗氧量和脑血流量，对脑缺血引起的空间认知障碍有改善作用;并能增加绝经大鼠脑内海马区的烟碱性乙酰胆碱受体数目，提高胆碱乙酰化转移酶的活性。茯苓含有增强脂质代谢及各种酶的辅酶物质，长期服用可使老龄大鼠内在性胆碱和乙酰辅酶A的含量增加，有抑制抗胆碱的作用[7]。临床研究也显示，以疏肝解郁为主治疗老年期痴呆病，除有助于改善患者的记忆力减退等症状外，还可显著改善其情绪抑郁、反应迟钝的状态，这对于减轻进一步的智能损害、防止病情加重具有重要的临床意义[8]。

本实验提示，经柴胡疏肝散干预后的大鼠神经元结构恢复较好，突触前膜内突触小泡清晰，突触间隙清晰，线粒体膜完整，线粒体嵴清晰可见。对比模型组电镜下神经细胞形态破坏明显，结构紊乱。突触密度降低，且均匀不一，突触间隙变小不清，突触小泡数量减少，游离核蛋白体减少，线粒体膜不完整，线粒体嵴模糊，解释了变性突触前膜和突触后膜模糊不清，突触间隙消失，直接导致神经信号传导障碍，使学习记忆能力下降。同时，柴胡疏肝散大剂量组经灌胃干预后，大鼠寻找平台的时间较灌胃前及同期模型组比较显著缩短(P＜0.01)，其对大鼠记忆能力的提高不低于补肾组。印证了疏肝理气方药对记忆、认知障碍的调节作用，充分显示了以疏肝理气立方在阿尔茨海默病治疗中的意义。比较而言，柴胡疏肝散高剂量组较低剂量组作用优势明显。

AD原因是复杂且渐进的，应从多方位、多靶点对本病从多个环节进行研究，期待有更多的实验研究为临床用药提供突破性的依据。

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